杜氏肌营养不良基因突变检测国家参考品的研制

于婷 孙楠 孙晶 黄杰 曲守方

杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是由肌营养不良蛋白（dystrophin）基因突变所致的X-连锁隐性遗传病，是一种严重的、致死性神经肌肉疾病［1-3］。DMD患者多在20 多岁死于呼吸衰竭或心力衰竭［4］，迄今为止尚无治愈的方法。因此，对DMD患者及携带者行基因诊断，以及高风险胎儿行产前诊断［5］，显得格外重要。目前DMD基因突变检测试剂盒均未取得医疗器械注册证，多在第三方检测机构使用或者仅用于科研。多家公司正在开展DMD检测试剂盒医疗器械注册证的申报，以便合法合规进入医院。建立DMD基因突变检测国家参考品可为这类试剂盒性能评价提供客观有效的评价手段。2019 起中国食品药品检定研究院（下称本院）开展了DMD基因突变检测国家参考品的研制工作。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本

外周血样来自中山大学附属第一医院、武汉康圣达医学检验所、广州市妇女儿童医疗中心。本研究的临床基本信息收集和临床血样的采集均获得了医院伦理委员会批准，以及患儿或家属的知情同意，签署了知情同意书。

1.2 试剂

多重连接依赖性探针扩增技术（MLPA）检测试剂盒（苏州贝康），SALSA MLPA 检测试剂（MRCHolland）；二代测序法（next generation sequencing，NGS）检测试剂盒：①半导体测序法：苏州贝康、东莞博奥木华；②可逆末端终止测序法：北京贝瑞和康、迈基诺、亚能（深圳）、欧蒙未一；③靶向测序法：成都纳海；④联合探针锚定聚合测序法：天津华大。

1.3 检测仪器

ABI 3730XL、ABI SeqStudio 及ABI 3730X 基因分析仪（赛默飞）；DA8600 Ion Proton 高通量测序仪（达安基因），NovaSeq 6000 基因测序仪及Miseq 基因测序仪（美国，Illumina 公司），BioelectronSeq 4000 基因测序仪（博奥生物），MGISEQ-2000 PE100 基因测序仪（华大智造）。

1.4 方法

1.4.1 样本筛选及采集

根据国内外文献报道的常见DMD突变，作为参考品备选范围，采集DMD患儿及其家系外周血（不少于10 mL），-70℃以下保存。

1.4.2 国家参考品制备

采用外周血建立DMD基因突变的永生化细胞系后，进行扩增及DNA 提取，最终每份样本每管稀释至25 ng/μL 左右。

1.4.3 国家参考品验证及均匀性、稳定性检验

8 个厂家采用了10 种检测试剂对参考品进行DMD基因突变位点的验证。本次验证仅给出家系信息，不给出DMD基因突变的具体信息。各参加单位根据试剂说明书或者实验室SOP 进行检测。要求：①NGS 试剂按照各自声称的检测限对样本测定1 次即可；MLPA 试剂按照原浓度和检测限浓度各测定1 次；②均匀性：NGS 试剂和MLPA 试剂各测定3 次；③稳定性：MLPA 试剂测定反复冻融3 次后的样本。

2 结果

2.1 参考品组成

共建系成功46 份样本，包含16 个家系及3 份独立的患儿样本。样本DMD基因突变信息包括：外显子缺失及重复，以及点突变或微小缺失，具体见2.2 验证结果。

2.2 验证结果

验证结果见表1，MLPA 法试剂检测结果一致，NGS 法试剂检测的结果，大部分一致，部分结果存在差异。

表1 DMD 基因突变检测候选参考品验证结果汇总表Table 1 The summary of validation results for the candidate reference of detection of DMD

2.3 参考品均匀性及稳定性结果

均匀性实验中，NGS 试剂和MLPA 试剂各自测定结果一致；稳定性实验中，MLPA 试剂测定反复冻融3 次后的样本，结果与正常保存样本的结果一致。

3 讨论

目前对DMD的分子诊断方法，主要可分为两种类型，即对外显子缺失和重复突变的检测，以及微小突变的检测。对于缺失和重复突变的检测主 要 有多 重PCR［6］、比 较基因 组杂交 芯片［7］及MLPA［8-9］等。多重PCR 法多用于明确先证者的突变类型后，对家系其他成员进行已知突变位点的检测；MLPA 作为一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的技术，可检测出DMD基因全部外显子的缺失和重复突变，并能检出携带者，应用最为广泛，商品化的MLPA 正逐步取代多重定量PCR 等方法；NGS 技术除可检测到缺失和重复外，可快速有效检测点突变和微小突变［10-11］。当前对DMD的基因检测策略普遍是先对患者进行MLPA 检测，然后对未发现突变的患者进行基因组DNA 分析［12-15］。本次验证过程中，即采用了上述的MLPA 法和NGS 法。

为评估DMD基因突变检测试剂盒的分析性能，DMD国家参考品的原料选用临床外周血，以保持与临床样本的一致性，并尽可能涵盖多种突变类型。MLPA 试剂检测结果一致，表明该方法成熟可靠。而NGS 结果不一致，主要原因如下：①选择了不同的转录本：NM_000109 和NM_004006，所以突变位点信息表述不同，但结果一致；②某实验室只检SNV/Indel 变异，所以未报DMD 外显子缺失或突变。在此基础上，再对有争议样本的突变信息分析：①3 号样本，仅2 家检出NM_004006.2：c.412_413delAA。对该位点设计引物进行Sanger 测序验证，确认该致病突变存在；②4、13、14、32、42、43 号样本，多家亦有检出其他突变位点，根据ACMG2015 指南判为VUS，无明确临床意义，不报告该突变；③37 号样本同时存在XO 情况，XX 部分为外显子5-7 杂合重复，XO 部分为外显子5-7 半合重复，并且XO 体细胞占比偏高导致了检测信号为纯合。因本参考品主要考察DMD基因突变情况，此处嵌合，不做评价，检出外显子5-7 重复即可；④当仅1 家与其他家结果不一致时，不采信该实验室结果（如10、22、38 号样本）。以上结果表明，检测结果出现差异时，应重点考虑两方面，一是当样本存在嵌合时，由于测序深度及嵌合程度的影响，可能出现DMD基因突变无法检出的情况；第二，对于突变是否具有致病意义的认识程度不同，未按照ACMG2015 指南进行突变的判断，以致给出过多无临床意义的突变信息。厂家对于检测到的突变信息应进行预先识别确认，不应测到即报，否则不仅给临床造成不便，而且对于患者及其家庭会造成一定的心里压力。通过协作验证，最终给出采用该参考品进行试剂盒质量评价的标准为：检测范围内的缺失、重复及突变位点均应检出；试剂盒检测范围外的突变应为野生型或未检出。因样本为临床样本，给出的突变信息仅限于根据当前指南判为致病的突变信息。如在应用过程中有检出的突变上升到致病等级，将在验证之后，及时更新相关信息。通过均匀性和稳定性研究，该参考品均满足要求，且应用性良好，可以作为国家参考品应用。今后还将对该候选参考品进行期间核查及长期稳定性研究。

目前已发现DMD致病突变位点类型达上百种，然而多数突变所致的发病率并不高，因此要想制备包括DMD全部突变的大panel 并不现实。这套国家参考品突变位点包含了主要的缺失突变、重复突变和微缺失突变三种类型，基本可以满足评价DMD检测试剂盒性能的要求，并且将在今后根据需要逐步扩充新的DMD突变基因突变位点。