牛乳中β-乳球蛋白检测方法的建立

杨爱君，纪坤发，杨美丰，利志锋，邢益俊，何瑛

（广东燕塘乳业股份有限公司，广东广州 510700）

牛乳中蛋白质的营养价值很高，是人类不可缺少的营养食品。牛乳蛋白质主要有酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白成分约80%，乳清蛋白成分约20%；乳清蛋白中的β-乳球蛋白是主要组分，约占乳清蛋白的50%[1]。牛乳中的β-乳球蛋白分子质量约为180000 u，等电点为5.1~5.3，一共由162个氨基酸残基组成，有2个遗传变异体。β-乳球蛋白在牛乳中主要以二聚体形式存在，由非共价键连接的2个单位亚基组成。在pH<3.5或pH>8.0时，β-乳球蛋白二聚体解离成单体。每个单体含有 2个二硫键Cys66-Cys160和Cys106-Cys199，还有1个Cys121自由硫氢基[2]。β-乳球蛋白具有多种生物学活性，在食品加工中有一定的应用；同时还具有降血压、抗菌、抗氧化、抗癌、免疫调节、降胆固醇等功效[3]。研究发现，β-乳球蛋白是牛乳中主要的热敏感蛋白质，过度加热会造成β-乳球蛋白变性并与乳中其他蛋白质形成大分子结构[4-6]。因此，检测牛乳中β-乳球蛋白含量可以判断牛乳热处理程度，对研究牛乳热处理方式的选择具有重大的意义。

目前，检测牛乳中β-乳球蛋白含量还没有国家标准，已发布的标准中有农业行业标准NY/T 1663-2008《乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定 聚丙烯胺凝胶电泳法》[7]和团体标准T/TDSTIA 007-2019《奶及奶制品中β-乳球蛋白的测量 液相色谱法》[8]。其中《乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定 聚丙烯胺凝胶电泳法》试样用SDS-PAGE凝胶电泳后，用光密度计对β-乳球蛋白进行测定分析而求得β-乳球蛋白的含量，该标准液态样品的检出限为240 mg/L，固液态和固体样品的检出限为2400 mg/kg[7]；《奶及奶制品中β-乳球蛋白的测量 液相色谱法》通过对样品进行调酸到 pH至 4.60时，酪蛋白及变性的乳清蛋白可以通过沉淀去除，滤液中未变性的β-乳球蛋白经离心后在高效液相色谱仪上，经蛋白质分离柱分离，选择210 nm检测波长，紫外光检测，外标法定量，该标准生乳、液态奶的定量限为25.0 mg/kg，乳粉的定量限为50.0 mg/kg[8]。前者操作方法繁杂，检出限高，后者检测时间长，均不适用于企业日常快速分析检测。

本文主要是开发用超高效液相色谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）来测定牛乳中β-乳球蛋白的含量的方法[9-19]。该方法前处理简便、分析时间短、测定结果准确、精密度好，能够准确而又快速检测牛乳中β-乳球蛋白含量。根据GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[20]通过加标试验结果从线性范围、精密度、正确度三个方面来验证方法的可行性。该方法为乳及乳制品中β-乳球蛋白检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Waters H-CLASS超高效液相色谱仪（配有PDA检测器），美国Waters公司；Waters BEH C4色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm粒径），美国Waters公司；Mettler Tledo XSR205DU电子分析天平，瑞士Mettler Tledo公司；Minipole 超纯水系统，默克化工；Sigma 2-16KL冷冻离心机，德国Sigma公司；移液器，德国Brand公司；Waters GHP针式滤膜，美国Waters公司。

乙腈、三氟乙酸（色谱纯），德国 Merck公司；冰醋酸（优级纯），广州化学试剂厂；β-乳球蛋白（L-046-100 MG），纯度：97.23%，Sigm a-Aldrich公司；本试验中用水符合GB/T 6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》[21]中一级水的规定。

1.2 试验方法

1.2.1 试验原理

牛乳中酪蛋白的等电点为4.60，因此当牛乳试样pH至4.60时，酪蛋白及变性的乳清蛋白可以通过沉淀去除，滤液中未变性的β-乳球蛋白经超高效液相色谱仪分离，经 PDA检测器测定，外标法标准曲线定量[8]。

1.2.2 试样前处理

准确称取5 g试样于50 mL离心管，加水至25 mL，混匀后再加入冰醋酸调节pH为4.60±0.05，涡旋震荡1 min，然后室温静置60 min，待试样沉淀分层，将试样高速离心（10000 r/min，4 ℃，15 min），取1 mL上清液，稀释至适当浓度，过0.20 μm针式滤膜，进行UPLC检测[5]。

1.2.3 溶剂的配制

很多朋友对排卵期出血并不陌生，也有一些病人跑来门诊就说：“医生，我排卵期出血，要吃什么药？”其实，排卵期出血应该是一种排除性疾病，就是说需要排除其他可能引起月经间期出血的疾病之后才能判断下来。

流动相①（0.1%三氟乙酸水溶液）：取900 mL一级水倒入1 L的容量瓶中，加入1 mL三氟乙酸后立即盖上盖子，轻摇至三氟乙酸全部溶解没有雾气，用一级水定容至刻度线，将容量瓶中的溶液全部转移至棕色蓝盖瓶中，超声脱气10 min；流动相②（0.085%三氟乙酸乙腈溶液）：取900 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中，加入0.85 mL三氟乙酸后立即盖上盖子，轻摇至三氟乙酸全部溶解没有雾气，用乙腈定容至刻度线，将容量瓶中的溶液全部转移至棕色蓝盖瓶中，超声脱气10 min；强洗溶液（90%乙腈水溶液）：取900 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中，用一级水定容至刻度线，将容量瓶中的溶液全部转移至棕色蓝盖瓶中，超声脱气 15 min；弱洗溶液（10%乙腈水溶液）：取100 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中，用一级水定容至刻度线，将容量瓶中的溶液全部转移至棕色蓝盖瓶中，超声脱气15 min。

1.2.4 色谱条件

经过测试，超高效液相色谱仪的色谱条件如表1。

表1 洗脱梯度Table 1 Elution gradient

色谱柱：Waters BEH C4 100 mm×2.1 mm，1.7 μm粒径；进样量：10 μL；柱温：60 ℃；流速：0.5 mL/min；检测波长：210 nm；流动相：流动相①为0.1%三氟乙酸水溶液、流动相②为0.085%三氟乙酸乙腈溶液；洗脱梯度：见表1。

1.3 标准工作曲线的制作

1.3.1β-乳球蛋白标准溶液（9211.57 mg/L）的配制

准确称取94.74 mg的β-乳球蛋白标准品（纯度：97.23%）于50 mL的烧杯中，记录称样量，用少量一级水进行溶解，并转移定容到10 mL容量瓶中，得到浓度为9211.57 mg/L的β-乳球蛋白标准溶液；

1.3.2β-乳球蛋白标准工作溶液的配制

取2 mL超高效液相色谱仪进样瓶5个，用移液器分别准确吸取 8.14 μL、16.28 μL、24.42 μL、32.56 μL、65.12 μLβ-乳球蛋白标准溶液（9211.57 mg/L），用一级水定容至1.5 mL，配置成浓度为50、100、150、200、400 mg/L的标准工作溶液。

β-乳球蛋白标准工作溶液通过超高效液相色谱仪分析，以标准工作溶液色谱峰面积为横坐标，标准工作溶液浓度为纵坐标绘制标准工作曲线。

1.4 计算

1.4.1 试样检测

将待测溶液上机检测，根据计算公式得到试样中β-乳球蛋白的含量。

1.4.2 计算公式

试样中的β-乳球蛋白的含量X按以下公式计算：

式中：X表示试样中β-乳球蛋白的含量，mg/kg；c表示待测样液中β-乳球蛋白浓度，mg/L；V表示加入水后定容体积，mL；m表示吸取试样的质量，g；F表示待测上清液稀释倍数；β-乳球蛋白的含量以β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B含量之和计。

1.4.3 数据处理

本方法所有试验均重复测定 6次，采用 Waters Empowe 3（版本号：7.30.00.00）软件进行数据处理。

2 结果与分析

根据GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[20]通过加标试验结果从线性范围、精密度、正确度三个方面来验证方法的可行性。

2.1 浓度范围、变异系数、回归方程、相关系数

对β-乳球蛋白标准工作溶液进行上机检测，标准工作溶液每个浓度点按 1.2.4的色谱条件重复测定 6次，得到标准工作溶液每个浓度点的色谱平均峰面积及其变异系数（CV），标准工作溶液色谱平均峰面积如表2，标准工作溶液色谱图如图1。

图1 β-乳球蛋白标准品色谱图50（mg/L）Fig.1 Standard working solution chromatogram 50 (mg/L)

表2 标准工作溶液色谱平均峰面积Table 2 Average peak area of standard working solution chromatography

从表2可知，本方法采用校准曲线法定量，标准工作曲线的浓度范围为50~400 mg/L，标准工作溶液每个浓度点重复测定 6次，变异系数（CV）在0.04%~0.23%之间符合标准要求，适合用于实际分析检测。

以β-乳球蛋白标准工作溶液色谱平均峰面积为横坐标，标准工作溶液浓度为纵坐标绘制标准曲线，做线性回归方程，得到β-乳球蛋白测定标准工作曲线浓度范围、回归方程、相关系数。β-乳球蛋白标准工作曲线浓度范围、回归方程、相关系数如表3，标准工作曲线如图2。

从表3、图2得到β-乳球蛋白标准工作曲线的浓度范围（50~400 mg/L）、回归方程（y=6E-05x+4.2877）、相关系数（R²=1.00）。本方法用校准曲线法定量，标准工作曲线在50~400 mg/L的浓度范围内线性良好，R²等于1.00，符合GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[20]采用校准曲线法定量，线性回归方程的相关系数不低于0.99的要求，可用于实际分析检测。

表3 标准工作曲线浓度范围、回归方程、相关系数Table 3 Standard working curve concentration range,regression equation, correlation coefficient

图2 β-乳球蛋白的标准工作曲线Fig.2 Standard working curve for-lactoglobulin

2.2 准确性和精密度

2.2.1 试样的检测

因为高温加热会使牛乳中β-乳球蛋白失去活性，所以分别使用某公司生产的超高温灭菌乳和巴氏杀菌乳按1.2的试验方法进行检测，每个样品设置6个平行试验，并与第三方检测机构（北京畜牧研究所）的结果对比，检测结果见表4，超高温灭菌乳、巴氏杀菌乳β-乳球蛋白色谱图见图3、图4。

图3 超高温灭菌乳β-乳球蛋白色谱图Fig.3 Chromatogram of high temperature sterilization milk β-lactoglobulin

图4 巴氏杀菌乳β-乳球蛋白色谱图Fig.4 Chromatogram of pasteurized milk β-lactoglobulin

从图3、图4、表4可知超高温灭菌乳的β-乳球蛋白含量为25.39 mg/kg，变异系数为0.92%，巴氏杀菌乳的β-乳球蛋白含量为3541.39 mg/kg，变异系数为0.14%,两种杀菌乳的重复测试稳定性较好，变异系数<1%,符合实际分析的要求；两种杀菌乳的检测结果与第三方机构检测结果无显著差异，偏差<1%。

表4 超高温灭菌乳、巴氏杀菌乳β-乳球蛋白含量Table 4 The content of ultra-high temperature sterilization milk and pasteurized milk-lactoglobulin

2.2.2 回收率和变异系数

从 2.2.1的试验结果默认超高温灭菌乳为低本底β-乳球蛋白含量，巴氏杀菌乳为高本底β-乳球蛋白含量，添加β-乳球蛋白标准溶液进行回收率测定，超高温灭菌乳β-乳球蛋白的具体添加量为200，300，400 mg/kg，巴氏杀菌乳β-乳球蛋白的具体添加量为2500，3200，4000 mg/kg，每个浓度的阳性试样设置六个平行试验，计算阳性试样的加标回收率及变异系数（CV），以评估方法精密度和正确度。阳性试样的加标回收率及变异系数（CV），见表5。

表5 阳性试样添加回收试验结果Table 5 Positive sample addition recovery test results

根据GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》附录 A要求，当被测组分加标浓度>100 mg/kg时，被测组分加标回收率范围在95%~105%之间；标准的附录B要求，被测组分含量在 100 mg/kg~1000 mg/kg时，测试结果的变异系数<3.8%；当被测组分含量在0.1%~1%时，测试结果的变异系数<2.7%[6]。

从表5可知，低本底的超高温灭菌乳β-乳球蛋白阳性试样的平均加标回收率在97.15%~99.11%之间，变异系数（CV）在0.53%~0.71%之间；高本底的巴氏杀菌乳β-乳球蛋白阳性试样的平均加标回收率在96.56%~98.43%之间，变异系数（CV）在0.04%~0.15%之间。可见阳性试样的本底值无论高还是低，本方法的精密度和正确度均符合上述标准要求。本方法加标回收率稳定，重现性高，可作为实际试样的准确定量检测方法。

2.3 讨论

目前测定β-乳球蛋白含量的方法很多，高星等建立的超高效液相色谱法可以快速检测牛乳中β-乳球蛋白含量，该方法标准曲线线性（R²=0.99）,方法回收率（70%~90%），变异系数（CV=0.93%~3.22%），检出限为40.0 mg/kg[22]；赵大伟等研究设计了可用于分析牛乳中β-乳球蛋白的高效液相色谱法，该方法分析时间长（t=30 min）,标准曲线线性（R²=0.99）,暂无写出方法回收率，变异系数（CV=2.9%）[23]；孙国庆等研究设计了可分析牛乳中β-乳球蛋白的毛细管电泳法，该方法标准曲线线性（R²=0.99）,方法回收率（75.2%~105.2%），变异系数（CV=1.09%~3.1%）[24]。而我们建立的使用超高效液相色谱法对牛乳中β-乳球蛋白进行检测的方法，其标准曲线线性（R²=1.00）,方法回收率（96.56%~99.11%），变异系数（CV=0.04%~0.71%），分析检测时间（t=9 min），检出限为20.41 mg/kg，方法定量限为61.23 mg/kg，均比上述方法有一定的优势，具有前处理简便、分析时间短、测定结果准确、精密度好等优点，能够准确而又快速检测牛乳中β-乳球蛋白含量。

3 结论

本文建立了超高效液相色谱法检测巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳中β-乳球蛋白含量的方法。通过验证表明，该方法线性关系良好（R²=1.00），平均回收率在96.56%~99.11%之间，变异系数在0.04%~0.71%之间，β-乳球蛋白方法检出限为20.41 mg/kg（S/N=3），方法定量限为61.23 mg/kg，符合标准GB/T 27417-2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》的要求。该方法简便易行、定量准确、精密度好，可用于液态乳中β-乳球蛋白的定量分析测定。