QuEChERS-气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定水产干制品中9种N-亚硝胺类化合物

陈丽香，陈嘉敏，陈燕敏，韩秋珍，冯志强

（广东省食品工业公共实验室，广东省食品工业研究所有限公司,广东省食品质量监督检验站，广东广州 511442）

N-亚硝胺类化合物是一类较强的致癌物，是最重要的化学致癌物之一，长期低剂量接触可以引起癌症[1,2]，一次性大量摄入同样有致癌的可能性。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构发布的致癌物清单，多种 N-亚硝胺类化合物列为一类、二类致癌物[3,4]。此类化合物广泛存在于腌制类食品、啤酒、化妆品、香烟、水、药品等物质中[5]，特别在腌制类食品中含有较高含量的亚硝胺类物质，对人体健康具有巨大的危害。

水产制品中的亚硝胺类化合物主要源于新鲜水产品在加工过程中产生的大量胺类化合物，胺类化合物跟硝酸盐和亚硝酸盐合成亚硝胺[6,7]，而硝酸盐和亚硝酸盐广泛存在于食物中。目前相关文献报道N-亚硝胺类化合物的检测方法主要有 GC法[8,9]、GC-MS法[10-13]、GC-MS/MS 法[14-17]、LC-MS/MS 法[18-20]等。其中大多数方法是对肉制品中 N-亚硝胺类化合物的检测，而使用GC-MS/MS对干制水产品中N-亚硝胺类化合物的检测的文献较少。目前国标 GB 2762-2017中规定了食品中N-二甲基亚硝胺的限量指标，其中干制水产品限量为4.0 μg/kg，指定按照GB 5009.26规定的方法测定。现行有效国标GB 5009.26-2016规定了两种检测方法，这两种检测方法均只检测N-二甲基亚硝胺一个项目。第一法前处理采用水蒸气蒸馏后经有机溶剂萃取，该方法取样量大，耗用试剂量大，实验过程复杂，实验耗时长，无法进行批量检测，回收率不稳定，且干制水产品基质复杂，干扰较为严重，导致一级质谱定性不准确容易造成 N-二甲基亚硝胺假阳性。第二法前处理跟第一法一致，使用热能分析仪进行分析，虽然该仪器对含氮化合物有高选择性，灵敏度高，但应用范围窄且价格昂贵，比较少实验室有配备。因此建立高灵敏度、定性准确的快速检测方法是很有必要的。本文采用QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）前处理，使用GC-MS/MS测定了干制水产品中9种N-亚硝胺类化合物的含量。实验证明，本方法前处理过程简单，耗时少，大大减少提取试剂，灵敏度高，定性准确，回收率稳定，可同时快速对干制水产品中9种N-亚硝胺类化合物进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干制水产品为市售。

9种亚硝胺类化合物混标溶液浓度为 2.00 mg/mL，smart solutions公司；乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷均为色谱纯，Honeyell公司；陶瓷均质子、MgSO4、NaCL、C18、PSA、EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管和EMR-Lipid Polish反萃管，美国安捷伦公司；实验用水为Milli-Q Advantage A10制备的一级水，美国Milli-pore公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪，Agilent GC 8890，QQQ 7000D，配拉出透镜高灵敏度离子源（EI），美国安捷伦公司；ROTINA 380R高速冷冻离心机，Hettich公司；MS 3basic旋涡混合器，德国IKA公司；Haier冰箱。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

将2.00 mg/mL的9种N-亚硝胺类化合物混合标准溶液用乙腈逐级稀释成浓度为1.00 μg/mL的混合标准工作液。

1.3.2 样品前处理

将干制水产品剪成小块，用组织捣碎机捣碎并混合均匀。制备好的试样于-18 ℃以下冷冻保存。

提取：称取10.00 g样品，置于50 mL离心管中，加入10 mL水，浸泡30 min，加入10 mL乙腈，振荡1 min，在-20 ℃冰箱中冷冻30 min，加入2个陶瓷均质子、4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，迅速振荡1 min，8500 r/min在0 ℃低温离心5 min，上清液待净化。

净化：取待净化上清液 5.00 mL加入到 15 mL EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管中（使用之前加5.00 mL水活化），振荡1 min，8500 r/min在0 ℃低温离心5 min，移取6.00 mL上清液转移到15 mL EMR-Lipid Polish反萃取管中，涡旋1 min，8500 r/min在0 ℃低温离心5 min，取上层清液经0.22 μm尼龙针头式过滤膜过滤，上机检测。

1.3.3 仪器分析参数

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：聚乙二醇石英毛细管柱 HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国安捷伦公司），色谱柱温度：50 ℃保持1 min，然后10 ℃/min程序升温到200 ℃，再以40 ℃/min程序升温到240 ℃，保持5 min；进样口温度：230 ℃；进样模式：不分流进样；进样量：1.5 μL；载气：氦气，纯度≥99.999%；流速：1.0 mL/min。

1.3.3.2 质谱条件

拉出透镜高灵敏度离子源（EI）；电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；质谱接口温度：240 ℃；采集模式：MRM模式；溶剂延迟：6 min。上述条件下，9种N-亚硝胺类化合物的保留时间、定量及定性离子对、碰撞电压（CE）如表1所示。

表1 9种N-亚硝胺化合物的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 9 N-nitrosamine compounds

1.3.4 数据处理

9种N-亚硝胺混合标准工作溶液和试样溶液通过气相色谱-三重四极杆串联质谱仪进行测试，以标准工作溶液中被测物峰面积为纵坐标（Y），以标准工作溶液中被测物的浓度为横坐标（X，μg/L），绘制标准曲线，根据标准曲线计算得到试样溶液中9种N-亚硝胺化合物的浓度（μg/L），如果试样溶液中9种N-亚硝胺化合物的浓度超出线性范围时应根据测定浓度进行适当稀释后再进行分析。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

9种 N-亚硝胺化合物的极性不同，考察了 9种N-亚硝胺化合物在弱极性、中等极性和强极性毛细管柱上的色谱行为。根据1.3.3仪器分析条件，分析质量浓度为5.00 μg/L的9种N-亚硝胺类化合物在上述3种极性的色谱柱的分离情况，总离子流色谱图如图1所示。结果表明：在弱极性石英毛细管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）上，NDPA、NMorPH和NPYR三个化合物分离度不好，基本重叠在一起，且均有后拖尾现象。中极性石英毛细管柱DB-1701（30 m×0.25 mm×0.25 μm）9种N-亚硝胺化合物均完全分离，但9个化合物均有后拖尾现象。强极性石英毛细管柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）9个化合物的分离度好，峰型对称，且灵敏度比另外两种色谱柱高，故选用HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）作为分析色谱柱。

图1 9种N-亚硝胺类化合物标液经不同色谱柱分离后的色谱图Fig.1 Chromatograms of nine N-nitrosamines separated by different chromatographic columns

2.2 质谱条件的优化

先采用MS1 SCAN的采集模式对9种N-亚硝胺类化合物进行分析，根据选择丰度高、干扰小的原则确定母离子，再采用二级质谱产物离子的采集模式，设置不同的碰撞电压，同选择母离子的原则确定子离子，最后采用MRM的采集模式对化合物的各个离子对的碰撞电压进行优化。在“1.3.3”所述条件下，分析质量浓度为1.00 μg/L的9种N-亚硝胺类化合物的混标溶液，得到色谱图，见图2。

图2 9种N-亚硝胺类化合物混合标准溶液（1.00 μg/L）的色谱图Fig.2 Chromatograms of 9 N-nitrosamine compounds in the mixed standard solution (1.00 μg/L)

2.3 提取液的选择

根据9种N-亚硝胺化合物的化学性质不同，分别选用了乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷进行提取效果比较。在空白样品中加入4.00 μg/kg的9种N-亚硝胺化合物混标溶液，除了加入提取试剂不同，其它实验步骤按照 1.3.2操作，乙腈提取的回收率范围在 85.73%~118.73%，乙酸乙酯提取的回收率范围在 51.13%~136.65%，二氯甲烷提取的回收率范围在 93.03%~129.48%。比较结果见图3。可以看出，乙酸乙酯对NDMA、NMEA、NPYR和NMorPh的提取效果差，回收率在60%以下；乙腈和二氯甲烷的提取效果相差不大，但二氯甲烷极性较弱容易将干制水产品中的油脂萃取出来，较难净化去除，对仪器污染严重且难以维护。而乙腈极性强不容易将干制水产品中的油脂萃取出来，故选择乙腈作为提取溶剂。

图3 不同试剂对9种N-亚硝胺类化合物提取效果的影响Fig.3 Effect of different reagents on the extraction efficiency of 9 N-nitrosamine compounds

2.4 净化条件的优化

干制水产品的基质干扰主要是脂肪和蛋白质等，复杂的基质产生的干扰影响定性和定量结果的准确性，且容易污染仪器，给仪器维护造成困扰。PSA常用于极性化合物的提取，可有效去除碳水化合物、有机酸、脂类和糖类等干扰物；C18可吸附非极性杂质，去除脂类、固醇及胡萝卜素等干扰物；EMR-Lipid可有效去除脂肪。故本次研究主要选择3种商品化净化管进行比较：A：EMR-Lipid dSPE增强型脂质去除净化管和EMR-Lipid Polish反萃管（除水）；B：含150 mg C18、150 mg PSA及900 mg无水硫酸镁的净化管；C：含150 mg C18、50 mg PSA及900 mg无水硫酸钠的净化管。

在空白样品中加入质量浓度为4.00 μg/kg的9种N-亚硝胺类化合物标准溶液，根据 1.3.2的提取步骤进行同步提取，提取液分别用A、B和C三种净化管进行净化处理，A净化管的回收率范围在 84.36%~108.26%，B净化管的回收率范围在96.62%~132.92%，C净化管的回收率范围在85.16%~121.82%，比较结果见图4。结果表明，B和C两种净化方式对脂肪的净化效果较差，干扰比较严重，回收率均有偏高的现象，而A净化方式对脂肪的净化效果理想，同时回收率比较稳定于80%~110%之间，故选用A净化管作为净化方式。

图4 不同净化方式对9种N-亚硝胺类化合物回收率的影响Fig.4 The influence of different purification methods on the recoveries of 9 N-nitrosamine compounds

2.5 标准曲线、检出限和定量限

分别准确移取一定量9种N-亚硝胺类化合物标准工作溶液，用乙腈配制成浓度为0.30、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L的标准工作溶液，在选定的仪器条件下进行分析，以定量离子对的峰面积为纵坐标（Y），以浓度为横坐标（X，μg/L），绘制标准曲线。如表2所示，结果表明，在0.30~50.00 μg/L的线性范围内，9种N-亚硝胺类化合物的线性关系良好，相关系数均大于0.999。根据大于3倍和10倍定量离子对信噪比确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），得出9种N-亚硝胺类化合物的检出限均为0.3 μg/kg，定量限均为1.0 μg/kg。国标GB 5009.26-2016中要求方法检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg，本方法灵敏度高可以满足干制水产品中9种N-亚硝胺类化合物检测要求。

表2 9种N-亚硝胺类化合物的回归方程和R2Table 2 Regression equation and R2 of 9 N-nitrosamine compounds

2.6 准确度和精密度

在鱿鱼、虾干、蚝干和干贝9种不含N-亚硝胺类化合物空白试样中分别添加1.00、4.00和10.00 μg/kg 3个水平做加标回收试验，每个水平做6平行，按照“1.3实验方法”进行试验，结果见表3。结果表明，9种N-亚硝胺类化合物的回收率在80.41%~113.73%之间，RSD在1.34%~11.80%（n=6）之间，符合GB/T 27404-2008附录F中回收率和精密度的要求。方法具有较高的准确度和精密度，可以满足9种N-亚硝胺类化合物的检测和分析要求。

表3 9种N-亚硝胺类化合物在干制水产品中的添加回收率和相对标准偏差Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the nine N-nitrosamines in dried aquatic products

2.7 实际样品检测

按照本文建立的方法对市售的虾干、干贝、章鱼干、柴鱼干、鱿鱼干、咸鱼干各5批共30批试样进行检测，其中有14批试样检出N-亚硝胺类化合物，检测结果见表4。其中NDMA检出13批，NDPhA检出10批，NPYR检出4批，NDEA检出3批，NDBA检出2批，NDMA和NDPhA的检出率高达43.00%和33.33%，且6批试样的NDMA含量高于食品安全国家标准 GB 2762-2017中干制水产品的限量值 4.0 μg/kg，不合格率为20%。

表4 实际样品中9种N-亚硝胺类化合物的检测结果Table 4 Detected results of the nine N-nitrosamines in real samples

3 结论

本文采用QuEChERS前处理方法，气相色谱-三重四极杆串联质谱测定干制水产品中9种N-亚硝胺类化合物的含量。访方法回收率范围在80.41%~113.73%之间，相对标准偏差在1.34%~11.80%（n=6）之间，9种N-亚硝胺类化合物的检出限均为0.30 μg/kg，定量限均为1.0 μg/kg，符合分析方法的要求，具有操作简单、灵敏度高和稳定性好的特点，与测定N-二甲基亚硝胺含量的GC-MS方法相比，GC-MS/MS测定法灵敏度高、定性更加准确，可同时应用于批量处理，快速定性和定量分析干制水产品中的9种N-亚硝胺类化合物。