不同有机酸对紫甘蓝花色苷辅色效应及热稳定性对比分析

潘颖，高庆超，孙晨晨，梁颖，王树林

（1.江苏省食品质量安全重点实验室，江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，江苏南京 210014）（2.青海大学农牧学院，青海西宁 810016）

紫甘蓝（Brassica oleraceaL.）又称紫包菜，属于十字花科，其生长周期短、适应性强、产量大，在我国大面积种植[1]。紫甘蓝中含有丰富的花色苷，其中主要以矢车菊素的糖苷为主[2]，每百克鲜重含量可达44.40~51.20 mg[3-4]。这是一类具有多项生理保健功能的黄酮类化合物，对人体脂质过氧化有抑制作用，可清除体内自由基、防治心血管疾病、抗菌抑制炎症、抗肿瘤、延缓衰老等[5-7]，以上特点赋予紫甘蓝花色苷优越的开发利用价值，但花色苷普遍稳定性差[8]，除受花色苷本身结构、浓度影响外，在食品生产加工和贮藏过程中极易受温度、pH、光照等外界条件影响[9]，因此其在实际生产应用过程中受限制，如何提高花色苷稳定性也就成了亟待解决的问题之一。

目前，常通过分子辅色、化学结构修饰和微胶囊技术等途径提高花色苷稳定性[10-12]。楼乐燕[13]发现单宁酸和绿原酸在杨梅花色苷水溶液中有增色和红移作用，显著提高杨梅花色苷色泽热稳定性。EIRO等[14]发现酚酸使不同花色苷单体产生了增色和红移效果，其中阿魏酸和咖啡酸显著提高天竺葵-3-葡萄糖苷的储藏稳定性。有机酸广泛存在于各类天然食品和加工食品中，是一类有效的辅色剂[15-16]，故本实验选择有机酸为辅色剂提高紫甘蓝花色苷稳定性有一定的参考意义。

本研究以实验室自提纯化紫甘蓝花色苷为研究对象，选取酒石酸、芥子酸、阿魏酸、单宁酸及咖啡酸为辅色剂，筛选辅色剂最佳辅色浓度，探究辅色剂对紫甘蓝花色苷的辅色效应及热稳定性，以期为紫甘蓝产品实际生产过程中花色苷稳定性的提高提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫甘蓝，2020年5月购自南京市苏果超市，新鲜、无损伤；酒石酸、芥子酸、阿魏酸、单宁酸、咖啡酸（纯度均≥98%），上海麦克林生化科技有限公司；甲酸、乙腈（均色谱级），上海麦克林生化科技有限公司；HCl、乙醇、氯化钾，上海凌峰化学试剂有限公司；无水乙酸钠，成都市科龙化工试剂厂；偏亚硫酸氢钾，上海泰坦科技股份有限公司；矮牵牛色素、飞燕草色素、锦葵色素、芍药花色素、天竺葵色素、矢车菊素（色谱纯，纯度均≥99%），美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

A11高速冷冻研磨机，德国IKA集团；Alpha-1506紫外可见分光光度计，上海谱元公司；3 nh全自动色差仪，深圳三恩时科技有限公司；GO酶标仪，赛默飞世尔科技公司；SHA-C恒温振荡器，常州国华电器有限公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机，金坛市白塔新宝仪器厂；Agilent 1200高效液相色谱系统，美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 紫甘蓝花色苷的提取与纯化

紫甘蓝花色苷提取与纯化参照毕凯媛等[17]方法略加改动。取新鲜紫甘蓝，切碎倒入高速冷冻研磨机中研磨至匀浆状态，以料液比（g/mL）1:15加入75%酸化乙醇（含0.1%柠檬酸）溶液，以KCl-HCl缓冲溶液（pH 1.0，0.25 mol/L）调节pH至2.5，加纤维素酶0.4%（质量分数），于50 ℃水浴锅中酶解60 min，后在100 ℃水浴中灭酶5 min，取出后迅速用冰袋冷却；酶解液在25 ℃下以400 W功率超声浸提15 min后8000 r/min离心15 min，得到紫甘蓝花色苷粗提液。取上述粗提液于旋转蒸发仪中，40 ℃水浴减压蒸馏得紫甘蓝花色苷浓缩液。大孔吸附树脂预处理参照文献[18]方法。称1 g预处理过的D-101大孔树脂加入40 mL上述浓缩液后置于恒温振荡器中，在 25 ℃以 120 r/min振荡吸附12 h，后用70%乙醇（含0.4%柠檬酸）洗脱液于25 ℃恒温振荡器以120 r/min洗脱6 h，抽滤收集洗脱液于 40 ℃减压旋转蒸发，-40 ℃冷冻干燥24 h得到紫甘蓝花色苷粉末，收集备用。

1.3.2 有机酸浓度对紫甘蓝花色苷辅色的影响

用pH 3.0的0.1 mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制1 mg/mL的紫甘蓝溶液和浓度为1 mg/mL的有机酸溶液，取1 mL紫甘蓝花色苷母液，分别添加0.08、0.32、0.48、0.64和0.80 mL的辅色剂（酒石酸、芥子酸、单宁酸），用pH 3.0的缓冲溶液定容至8.00 mL（以1 mol/L HCL和/或5 mol/L NaOH调节pH为3.0），使辅色剂浓度分别为0.01 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL和0.10 mg/mL。以不加辅色剂的溶液为对照。混匀后，将混合物置于 20 ℃下避光静置2 h，在400~700 nm波长范围内扫描，记录其可见光吸收光谱。以此筛选出有机酸的最佳辅色浓度用于下一步试验。

阿魏酸和咖啡酸难溶于水，易溶于乙醇溶液，故用15%乙醇配制pH 3.0的缓冲溶液，配制浓度为1 mg/mL的阿魏酸和咖啡酸溶液，其他操作同上。

1.3.3 有机酸对紫甘蓝花色苷热稳定性的影响

用pH 3.0的0.1 mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制1 mg/mL的紫甘蓝花色苷溶液，取1 mL母液，分别加入0.80 mL的不同辅色剂（酒石酸、芥子酸、阿魏酸、单宁酸和咖啡酸），用缓冲溶液定容至 8.00 mL，并用1 mol/L HCL和/或5 mol/L NaOH调节pH为3.0，混匀后分别置于70、80、90 ℃水浴锅中加热5 h，每隔1 h取样冷却至室温，测最大吸光度、最大吸收波长及褐变指数变化[19]、用全自动色差仪测定样品的 CIELAB 三刺激颜色 L*、a*、b*值[20]，并用Photoshop将色差值以直观的色块颜色图展现[21]。以此判断有机酸提高紫甘蓝花色苷热稳定性的效果。

1.3.4 有机酸对紫甘蓝花色苷热降解动力学参数的影响

在恒温加热条件下，花色苷的降解遵循一级动力学模型[21-22]，由式（1）~（3）计算一级动力学模型的速率常数K、半衰期t1/2、活化能Ea[23-24]；花色苷递减时间D值和Z值分别通过式（4）和（5）计算[25]；根据Gibbs-Helmholtz方程计算吉布斯自由能ΔG、焓变ΔH和熵ΔS[26]，如式（6）~（8）所示。

式中：C0为初始时刻溶液花色苷浓度，mg/mL；C为一定处理下溶液花色苷浓度，mg/mL；Ea为活化能，kJ/mol；R为气体常数，R=8.314 J/mol·K；T为绝对温度，K；K0为频率因子，h-1。

式中：k为T ℃下的降解速率，h-1；T为温度，℃。

式中：Ea为活化能，kJ/mol；h为普朗克常数，h=6.6262×10-34J/s；kB为玻尔兹曼常数，kB=1.3806×10-23J/K；T为绝对温度，K；k为降解速率，h-1。

1.3.5 紫甘蓝花色苷辅色前后组分分析

取一定量各有机酸辅色前后的紫甘蓝花色苷溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，进行高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析。参考胡莉[27]液相色谱条件稍作修改：SB-C18（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）色谱柱；流速0.8 mL/min，柱温：35 ℃，检测波长：525 nm，进样量20 μL；流动相A为体积分数1%甲酸水溶液、B为1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱条件：0~12 min，92%~75% A，12~20 min，20%~92% A，25%~80% B，20~30 min，20%~92%A。

1.3.6 统计与分析

每个实验均为3组平行，采用Origin 2018和SPSS 22.0软件进行比较分析。测定结果以平均值±标准差表示。实验数据采用ANOVA进行邓肯氏（Duncan’s）差异分析，p<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 有机酸浓度对紫甘蓝花色苷辅色的影响

图1为不同浓度下各有机酸与紫甘蓝花色苷发生辅色反应的可见光吸收谱图。由图1可知，5种有机酸对紫甘蓝花色苷均有辅色效应，辅色效应随有机酸浓度升高而加强，当有机酸浓度增加到 0.10 mg/mL时，酒石酸、芥子酸、阿魏酸、单宁酸和咖啡酸辅色组最大波长处的吸光值（Aλmax）较对照分别增加了71.64%、62.69%、52.99%、59.70%和 61.19%，说明以上有机酸均可辅色紫甘蓝花色苷，有较好的辅色效果。分析原因可能是无色的有机酸与花色苷黄烊盐离子结合导致平衡朝着生成黄烊盐离子方向移动，且高浓度的有机酸中羟基更易与AH+发生分子间非共价键辅色作用[28]，保护花色苷不受水的亲核攻击，从而减少无色的半缩酮和查尔酮的形成，以此来提高花色苷的辅色效果[29-31]。

图1 不同浓度有机酸与紫甘蓝花色苷辅色后的可见光吸收图谱Fig.1 Visible absorption spectra of the solution after copigmentation of anthocyanin with co-pigments at different concentrations

相关文献也有报道[32]，Sun等人发现有机酸对红树莓提取物中矢车菊素类花色苷的辅色作用随其摩尔比增大而加强，当花色苷与有机酸摩尔比达到 1:100时表现出最强的辅色作用。该结论与本实验结论一致。也有实验指出[33]，阿魏酸辅色黑果枸杞花色苷时最佳辅色浓度为0.012 mol/L，继续增大辅色浓度至0.014 mol/L，溶液吸光度下降，加速了花色苷降解。分析原因可能是，不同化学结构的有机酸作用于不同来源的花色苷，进行不同的理化反应，造成结果差异。

2.2.2 有机酸对紫甘蓝花色苷热稳定性的影响

如图2所示，70 ℃下加热1 h酒石酸和芥子酸组Aλmax分别为 0.37和 0.33，较对照 0.29差异显著（p<0.05），咖啡酸组加热3 h后Aλmax较对照差异显著（p<0.05），阿魏酸和单宁酸组在5 h内较对照始终差异不显著（p>0.05）；80 ℃加热2 h除阿魏酸组外的有机酸组Aλmax均较对照显著提高（p<0.05），阿魏酸组在3 h时Aλmax也较对照差异显著（p<0.05），但阿魏酸和单宁酸组加热5 h的Aλmax分别为0.11和0.13较对照无显著差异（p>0.05），可能是因为随加热时间延长，这两种有机酸被耗尽，无法充分作用于紫甘蓝花色苷；90 ℃下加热1 h后各有机酸辅色组均显著提高Aλmax（p<0.05），加热5 h阿魏酸和单宁酸组Aλmax较对照不再显著（p>0.05）。

图2 热处理对不同有机酸体系下紫甘蓝花色苷溶液Aλmax的影响Fig.2 Effect of heat treatment on the absorbance of purple cabbage anthocyanin solution Aλmax under different organic acid systems

以上说明有机酸辅色组紫甘蓝花色苷 Aλmax较对照均有提高，酒石酸、咖啡酸对紫甘蓝花色苷热稳定性的提高效果较其他有机酸强。李丹[34]在巨峰葡萄花色苷溶液中加入 0.1%咖啡酸，最大吸光度增加32.40%。可能是这类有机酸与花色苷结合，因堆积作用，使水化反应敏感性降低，出现明显的增色效应[35]。文献研究发现咖啡酸加入赤霞珠葡萄花色苷溶液后，在Π-Π共辄、氢键的作用下，形成高空位阻，提高了溶液贮藏期的稳定性[36]。

由表1可知，热处理5 h的有机酸辅色组均使紫甘蓝花色苷λmax红移、出现增色效应。70 ℃、80 ℃和90 ℃下酒石酸、芥子酸和咖啡酸组分别红移4 nm、4 nm和3 nm；6 nm、3 nm和2 nm；7 nm、7 nm和5 nm，因辅色组λmax在527 nm~535 nm范围内变化，故仍属于花色苷特征吸收波长范围[37]。对照组花色苷在70 ℃下λmax未变化、80 ℃和90 ℃下分别蓝移5 nm和3 nm，花色苷稳定性破坏严重。综上，有机酸辅色可提高紫甘蓝花色苷的热稳定性，酒石酸辅色对花色苷热稳定性的提高效果最佳。苏帆等人[38]在红肉苹果花色苷溶液中加入4种酚酸后，红肉苹果花色苷产生了明显的增色效应和红移现象；张晓圆[52]发现黑豆红花色苷溶液在经过有机酸辅色后最大吸收波长向长波长方向移动，由513 nm变到517 nm左右，说明花色苷的最大吸收峰发生了红移的现象。以上实验结论可佐证本实验结论。

表1 热处理对不同有机酸体系下紫甘蓝花色苷溶液λmax的影响Table 1 The effect of heat treatment on the λmax of purple cabbage anthocyanin solution under different organic acid systems

由图3可知，有机酸辅色组紫甘蓝花色苷褐变指数（BI）较对照上升缓慢。有研究指出，溶液BI值会随花色苷的降解而不断增大[39]。5 h内70 ℃下酒石酸组BI始终较对照差异显著（p<0.05），芥子酸和咖啡酸在2~3 h内BI较对照有显著差异，阿魏酸和单宁酸组BI始终较对照无差异显著（p>0.05）；80 ℃和90 ℃加热5 h酒石酸、芥子酸和咖啡酸组花色苷BI组内差异不显著（p>0.05），其BI值均在1 h后较对照显著降低（p<0.05），80 ℃下加热4 h的咖啡酸组BI较对照差异不再显著（p>0.05），而阿魏酸和单宁酸组在5h内较对照BI始终差异不显著（p>0.05），90 ℃下单宁酸组BI在5 h时较对照显著降低（p<0.05），5 h内阿魏酸组BI均与对照无显著差异（p>0.05）。综上，随温度升高及时间延长，酒石酸组对延缓紫甘蓝花色苷BI上升的效果始终最佳、阿魏酸组效果较差。此结论与本实验吸光度、最大吸收波长结论一致。

图3 热处理对不同有机酸体系下紫甘蓝花色苷溶液褐变指数的影响Fig.3 Effect of heat treatment on the browning index of purple cabbage anthocyanin solution under different organic acid systems

由图4知，紫甘蓝花色苷L*值随加热时间延长而升高，a*、b*值下降。表明随加热时间的延长，溶液色泽亮度变浅、红色度降低、褐色度增加，其原因是较长时间加热花色苷发生降解，生成棕褐色物质[40]。在70、80、90 ℃下，紫甘蓝花色苷辅色后的L*值由大到小依次为：对照、阿魏酸、单宁酸、咖啡酸、芥子酸、酒石酸；a*值由大到小依次为：酒石酸、芥子酸、咖啡酸、单宁酸、阿魏酸、对照；b*值受温度影响变化不大。说明在实验温度下有机酸辅色组均可减缓紫甘蓝花色苷溶液色泽的褪色速率，其中酒石酸辅色效果最佳，阿魏酸较差。张锦钰等[41]发现紫淮山花色苷随加热时间增加，溶液亮度L*值逐渐增大，红值a*减小，加热促使紫淮山花色苷结构变化，使其由红色黄烊盐阳离子向蓝色醌型碱转变[42]，但0.2%没食子酸和0.03%谷胱甘肽对花色苷褪色速率有一定的抑制作用。

图4 紫甘蓝花色苷溶液辅色后L*、a*、b*值随加热时间的变化Fig.4 Changes of L＊、a＊、b＊ values of purple cabbage anthocyanins solution after copigmentation with time

图5是用Photoshop绘制的色差值色块图。可直观的看到热处理下对照和有机酸组紫甘蓝花色苷溶液颜色变化情况。随着温度升高、时间延长，花色苷溶液颜色逐渐变浅、红色度降低、褐色度增加，其中90 ℃下颜色变化最剧烈，80 ℃次之，70 ℃下颜色变化较难用肉眼识别。故就紫甘蓝花色苷而言，在70~90 ℃加热5 h后，酒石酸辅色组的还原色块红色度相比对照明显偏高，说明酒石酸减缓紫甘蓝花色苷溶液褪色的效果较好，对增强花色苷溶液的热稳定性有明显作用，而阿魏酸对提高花色苷热稳定性效果较差。楼乐燕[13]以相同分析方法发现无论加热温度高低，单宁酸辅色杨梅花色苷色度值变化明显，辅色效果佳。

图5 紫甘蓝花色苷溶液辅色后还原色块图随加热时间的变化Fig.5 Changes of color swatches of purple cabbage anthocyanins solution after copigmentation with time

2.2.3 有机酸对紫甘蓝花色苷热降解动力学参数的影响

研究表明，植物花色苷降解基本符合一级动力学模型[43-44]，二级、多级反应报道较少。按1.3.4方法，假设紫甘蓝花色苷在有机酸体系下降解符合一级动力学模型。对酒石酸、芥子酸、阿魏酸、单宁酸和咖啡酸花色苷体系，以加热时间 t为横轴，-ln(Ct/C0)为纵轴作图，得一级反应线性关系（R2>0.9）。再由一级动力学模型分析相关热力学参数以预测花色苷与有机酸之间的能量交换过程、了解辅色机理。结果见表2。

由表2，有机酸体系下紫甘蓝花色苷热降解符合一级动力学（R2>0.9），不同温度下，对照和有机酸组的热降解速率均随温度升高而增加，此结果与不同来源如紫甘薯[45-46]、黑莓[15]等的有机酸辅色花色苷降解动力学结果一致。有机酸组均可提高紫甘蓝花色苷的活化能，其中酒石酸的Ea最大为48.80 kJ/mol、阿魏酸的Ea最小为17.50 kJ/mol，且酒石酸Z值最小为32.80 ℃，对照组则为118.02 ℃，表明酒石酸辅色的花色苷热降解所需能量最高，反应最难进行，酒石酸组紫甘蓝花色苷热稳定性最强；相同温度下，有机酸组花色苷半衰期均高于对照，70 ℃酒石酸、芥子酸、阿魏酸、单宁酸和咖啡酸的t1/2分别为42.52、35.19、16.74、21.80和29.12 h较对照9.47 h提高，随温度升高，紫甘蓝花色苷的半衰期均减小、热稳定性均降低。可见，紫甘蓝花色苷的热稳定性可由以上有机酸辅色来提高。实验吉布斯自由能 ΔG>0，辅色为非自发过程且受温度变化影响小；焓变值ΔH取决于反应温度[47]，实验ΔH均为正且受温度变化影响较小，说明有机酸与花色苷相互作用为吸热反应且降解过程中势垒大小与温度无关；熵变值 ΔS<0，该反应的均匀度降低[48]，其中酒石酸组的 ΔS绝对值（135.34~145.54 J/mol）明显低于对照组 ΔS绝对值（230.03~230.57 J/mol），故紫甘蓝花色苷在酒石酸辅色时对温度较不敏感、花色苷热稳定性提高较明显。

表2 不同有机酸体系紫甘花色苷溶液在70~90 ℃热处理条件下热力学参数Table 2 Kinetic parameters of purple anthocyanin solutions of different organic acid systems under heat treatment at 70~90 ℃

2.2.4 紫甘蓝花色苷辅色前后组分分析

如图6是紫甘蓝花色苷经酒石酸、芥子酸、阿魏酸、咖啡酸和单宁酸辅色前后的HPLC谱图。结果显示以上有机酸辅色组均没产生新的峰，均无衍生物生成，与对照组花色苷组分一致。有研究通过液相色谱-质谱法分析发现[49-50]，紫甘蓝中所含花色苷基本为矢车菊色素的一系列糖苷及其酰化物。因此，从紫甘蓝花色苷结构上分析，可能是紫甘蓝花色苷酰化程度高，难以再与有机酸发生共价结合生成新的花色苷衍生物，初步判断这5种有机酸可能是通过氢键和疏水相互作用来辅色的[51]，花色苷和辅色剂形成的复合物一般是水平连接[52]或垂直折叠[53]的。Zhang等[47]发现多酚物质对锦葵色素-3-葡萄糖苷的辅色是非共价结合的，是由Π-Π堆叠形成更稳定的复合物来提高花色苷的稳定性。张晓圆[54]发现有机酸辅色黑豆红花色苷时，辅色前后花色苷成分未变化属于分子间辅色。以上文献均可佐证本实验结论。

图6 紫甘蓝花色苷辅色前后液相色谱图Fig.6 HPLC profiles of purple cabbage anthocyanins before and after copigmentation

3 结论

酒石酸、芥子酸、阿魏酸、单宁酸和咖啡酸对紫甘蓝花色苷均有辅色效应。紫甘蓝花色苷Aλmax随有机酸浓度增加而增大，在70、80、90 ℃下加热5 h，有机酸辅色组花色苷较对照均出现增色效应和红移现象，紫甘蓝花色苷褐变指数上升缓慢，有机酸延缓花色苷降解；有机酸组紫甘蓝花色苷溶液色差值L*、a*、b*值变化减缓、色泽褪色速率下降，有机酸辅色紫甘蓝花色苷热稳定性提高，酒石酸作用效果最佳，阿魏酸较差。由热降解动力学分析，紫甘蓝花色苷热降解符合一级动力学（R2>0.9），70~90 ℃下加热5 h，有机酸组t1/2均高于对照，酒石酸Ea最大为48.80 kJ/mol、阿魏酸Ea最小仅有17.50 kJ/mol，且酒石酸Z值最小为32.80 ℃，对照组为118.02 ℃，实验ΔG和ΔH均>0，辅色过程为非自发吸热且受温度变化影响较小、降解过程中势垒大小与温度无关，ΔS<0且酒石酸组ΔS绝对值低于对照，酒石酸提高花色苷热稳定性效果好。HPLC结果说明有机酸辅色紫甘蓝花色苷均未产生新衍生物，可能是通过非共价键（氢键和疏水相互作用）与紫甘蓝花色苷分子间辅色。