检测角度对激光诱导荧光光谱技术检测花生油AFB1污染的影响研究

2021-09-02庞妍妍何学明

中国粮油学报 2021年7期

陈敏庞妍妍何学明沈飞

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏高校现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210023)

花生油颜色淡黄透明、滋味可口，具有适宜的油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸比例，易于身体消化吸收，且含有磷脂、维生素E、胆碱等对人体有益的物质，深受消费者喜爱[1]。花生作为花生油的原料，在生长、收获和贮藏过程中极易受到真菌的侵染，而霉菌代谢产生的AFB1在花生油生产过程中，会侵入油相，从而导致花生油中毒素超标，对人类健康造成严重的威胁[2]。

目前，检测AFB1的方法主要是薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法 (HPLC)[3]、酶联免疫吸附法 (ELISA)等[4]。然而，这些方法通常成本高、耗时长，难以实现现场实时快速检测。近年来，光谱技术因样品预处理简单、快速无损等特点成为最具有检测潜力的一类方法[5]。其中，荧光技术因高灵敏度、特异性强、操作简单等优点，在农产品检测方面得到了广泛的应用[6，7]。具有荧光特性的物质受到紫外波段辐射激发后，会发射出比激发光波长更长的可见光，称之为荧光。对于不同物质其分子构成不同，受辐射激发的波段、发出的荧光信号也不同。利用荧光技术检测农产品中AFB1早有报道，1969年Marsh等[8]表明棉籽AFB1与蓝绿色荧光 (blue green yellow fluorescence, BGYF)具有高相关性。近年来，基于荧光技术检测葡萄酒[9]、玉米[10]、花生[11]、面粉[12]等农产品中存在的AFB1也有大量研究。与使用汞灯、发光二极管或氙灯等光源作为激发光的传统荧光检测方法相比，LIF检测技术由于使用单一激发波长的高功率激光器，其灵敏度会更高[13]。Wu 等[14]利用研发的LIF系统对污染AFB1的开心果进行识别时，发现使用三个荧光探头接收荧光时比只用一个荧光探头的正确率高7%。这一结果说明当样品受到激发光激发后，周围均产生荧光。因此有相关学者研究了荧光检测角度对实验结果的影响。其中，有学者研究了不同角度的LIF技术检测开心果中四种黄曲霉毒素[15]、牛奶的新鲜度[16]、橄榄油掺假[17]，结果表明当激光束与检测光纤夹角为36°时，检测开心果黄曲霉毒素的灵敏度和信噪比最高；样品与光束之间的角度60°时，预测牛奶新鲜度效果最好；检测角度为90°时，橄榄油掺假预测精度最高。由此可见自主研发的LIF系统对不同样品光路是有区别的，其发射的荧光信号和散射光也是具有差异性的。因此，利用LIF技术精确检测花生油中AFB1，选择一个合适的检测角度是至关重要的。

尽管有较多研究利用荧光技术检测AFB1，而对于激光诱导荧光技术大多是鉴定食用油掺假问题，有少量报道该技术用于开心果、花生等坚果中AFB1的检测，因花生油液体样本复杂，受背景荧光干扰严重等问题，用LIF测定植物油中的AFB1尚未报道。因此，本研究拟研发一套LIF系统，比较不同荧光角度对检测结果的影响，探索LIF技术在检测花生油中AFB1的应用潜力。以花生油为研究对象，分析在不同角度下，花生油污染AFB1所产生的特征光谱，结合化学计量学方法，建立区分AFB1污染超标花生油的定性模型，并利用定量模型探讨了样品的荧光光谱与AFB1含量的相关性。以期为实现花生油中AFB1的快速识别和早期预警提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及样品制备

一级花生油：市售，密度为 0.9 g/mL；黄曲霉毒素标品(纯度≥98%)；乙腈(色谱纯)；振荡器；精密量角器。

为了验证研发LIF系统检测花生油中AFB1的可行性，优化系统的光路，用乙腈配制10 000 μg/L的AFB1标准溶液备用，每个样品用50 mL的量筒准确量取40 mL花生油，根据国标对花生油中AFB1的限量标准，制备花生油污染AFB1水平为0、5、10、20、25、30、40、50 μg/kg，每个AFB1污染水平均配制15个样品，另外准备15个纯花生油作为对照组，总计135个样品。每个样品均是当天配制，配制好的样品放置在振荡器上振荡5 min后，在黑暗中常温静置2 h后再采集光谱。LIF系统的3个检测角度使用量角器精确测量后固定。样品的详细配制情况见表1。

表1 样本制备的详细情况

1.2 实验方法

本研究自主研发的LIF光谱实验装置原理图如图1所示。实验采用的是MW-GX-375的固体连续激光器作为激发光源(波长为375 nm，功率范围0～137 mW可调)。激光束通过芯径为1 000 μm的光纤经过准直镜(COL-20K)垂直照射在样品表面。置于比色皿中的20 mL样品吸收激光能量后，释放特征荧光经过长波通滤光片(LPF400)到准直镜(74-uv-02)，从不同方向由芯径为1 000 μm的光纤传输至光谱仪(QE pro)进行荧光光谱分析。光谱采集范围为200～1 000 nm，积分时间设置为2 s，每个样品采集两次，光谱采集的整个过程均在避光的暗箱中进行，为避免环境变化对样品采集的荧光产生不同影响，在实验过程中必须保证实验环境的一致性。

注：1 暗箱，2 光谱仪，3 电脑，4 接收准直镜，5 滤光片，6 样品台，7 样品，8 激发准直镜，9 光纤，10 激光器，11 电源，12 可调整检测荧光角度(30°、60°、90°)。图1 LIF检测系统示意图

1.3 实验数据处理

采用UnscrambleX 10.4和Matlab 2015b软件对采集的荧光光谱进行分析处理。首先，建模之前先用ken-stone(KS)算法将数据集划分为建模样本集(总样本数的2/3)和预测样本集(总样本数的1/3)。其次，运用主成分分析 (PCA) 分析污染不同水平 AFB1花生油的聚类趋势，在通过线性判别分析 (LDA)、偏最小二乘判别分析 (PLS-DA)、支持向量机 (SVM) 将样品划分成不超标 (AFB1污染水平<20 μg/kg) 和超标 (AFB1污染水平≥20 μg/kg)，建立偏最小二乘 (PLSR) 定量模型。评估定性模型的指标是判别正确率。评估PLSR模型性能的主要指标有：模型决定系数(R2)、建模均方根误差(RMSEP)和预测均方根误差(RMSEP)、相对分析误差(residual predictive deviation, RPD)、最低检出限(LOD)等，其中RPD为预测集标准偏差与预测均方根误差的比值。

2 结果与分析

2.1 不同角度采集荧光信号的光谱分析

污染不同水平AFB1的花生油在3个检测角度的平均荧光原始光谱如图2所示。同一样品在3个角度的荧光峰形状相似，其中对照组的峰形与0 ppb组样品峰形基本重叠，说明用乙腈配制的AFB1标准溶液对花生油荧光信号没有影响。当研发的LIF检测角度为60°时，样品荧光强度最高，而研发的LIF检测角度为30°时，样品荧光强度最弱且荧光峰发生红移。图2显示，不同污染水平样品在400～600 nm、600～800 nm范围的荧光峰存在明显差异。植物油在350～420 nm激发下出现在610～800 nm的荧光峰与叶绿素有关[18]，而在400～600 nm的荧光峰应是由维生素B2、类胡萝卜素以及脂肪酸的氧化产物等荧光团共同产生、叠合而成的荧光宽峰[19]。在紫外光的激发下，AFB1的荧光峰出现在428 nm左右[20]。从3个检测角度采集荧光信号总体上都是随着污染浓度的增加，荧光值也在增强，尤其是在400～600 nm，荧光强度增强幅度更大。这可能是低浓度的AFB1荧光信号会与花生油中的荧光物质发生交叉影响[21]。尽管荧光值随着污染浓度的增加而增强，但在400～800 nm范围内，没有单个特征峰可以直接表示与AFB1相关，因此，为了提取与AFB1污染有关的关键光谱信息，需要借助化学计量学方法进一步分析400～800 nm的光谱。

2.2 主成分分析

利用所研发的LIF系统采集污染AFB1花生油的3个检测角度的主成分分析结果如图3所示。总体而言，超标花生油和不超标花生油在主成分得分图上并不能完全区分开，尤其是当研发的LIF系统检测角度为30°时，分离效果最差。这可能是由于荧光在30°检测时受到散射效应的影响最大。也可能是微量的AFB1在花生油中荧光信号强度较低，而花生油本身的荧光容易掩盖AFB1特性信号[22]。当研发的LIF系统检测角度为60°和90°时，PC1和PC2 两个主成分贡献之和达到了84%。其中PC1占主要贡献值。可能物质的大多数物理差异均是PC1导致的[23]，这为进一步的判别分析提供了基础。

注：a 检测角度为30°；b 检测角度为60°；c 检测角度为90°。

注：a为检测角度为30°；b为检测角度为60°；c为检测角度为90°。

2.3 判别分析结果

花生油从不同检测角度的3个判别模型结果如表2所示。当检测角度为30°时，400～600 nm的预测集在判断不超标样本时正确率只达到81%，这可能是不超标样本中AFB1含量太低，受花生油本身荧光影响大。另外，当研发的LIF检测角度为60°时，在600～800 nm范围建立模型的正确率整体要比其在400～600 nm建立模型的正确率高。尽管AFB1的荧光特征峰位于425～500 nm，但花生油在污染AFB1后光谱的差异性不仅是AFB1本身的差异性，还与样品本身荧光物质有关[24]。然而，当研发的LIF检测角度为90°，建模波段为400～600 nm时，SVM模型的各个指标正确率均达到100%。由此可见，当荧光检测角度为90°时，可最大程度地减少透射光与散射光的影响[25]。因此，在研发LIF系统用于检测判别花生油中AFB1是否超标时，检测角度设置为90°，结合SVM在400～600 nm建立的判别模型可展现更高的精度优势。