乳酸菌发酵降镉处理对大米淀粉结构和理化性质的影响

张永兰 林利忠,2

(中南林业科技大学食品科学与工程学院；稻谷及副产物深加工国家工程实验室1，长沙 410000)(金健米业股份有限公司2，常德 415001)

镉是地壳中的自然元素，通过自然和人为的行为释放出来，是一种有毒元素[1]。同时，镉以多种方式进入人体，除了呼吸和皮肤接触，饮食摄入被认为是镉暴露的主要方式[2]。大米及其制品是镉的主要摄入来源之一，Shi等[3]评估了全球精米市场供应链中的镉浓度，并与欧洲标准进行了比较，全球供应链的5%超过了200 μg/kg。我国三分之二左右的人口以大米为主食，但是部分区域受到重金属镉污染，严重威胁粮食和食品安全。

乳酸菌发酵可以有效去除稻米中的镉。刘也嘉等[4]研究了乳酸发酵脱除大米重金属镉的工艺，在加水量120%、强化菌种添加量0.08‰、发酵温度32 ℃的条件下，降镉率可达79.24%。Zhai等[5]通过研究发现植物乳杆菌中菌株CCFM 8610具有较高的镉去除率，在加水量120%、菌种添加量1%、37 ℃发酵24 h的条件下，镉的去除率可达93.37%。Zhu等[6]通过混合乳酸菌发酵大米米粉，优化后的最佳工艺是用8%的混合乳酸菌种在35 ℃下发酵28 h，可使米粉中镉的含量降低87.6%。这些研究表明，乳酸菌发酵是一种有效的方法，这也意味着用乳酸菌发酵从大米中去除镉，是开发安全大米食品的一种策略。

大米淀粉是人类饮食中碳水化合物的主要来源[7]，也是影响大米可加工性中最重要的成分[8]。与其他淀粉相比，大米淀粉具有小颗粒形态，无异味，口感顺滑，低过敏性等独特的特性[9]。碱溶酸沉法提取的大米淀粉分为白淀粉与黄淀粉，且黄淀粉中含有的蛋白质与淀粉之间可能通过特殊化学键紧密结合，也可能被包埋在淀粉颗粒间[10]，故不能用碱液轻易去除其中的蛋白质[11]。从镉在大米各组分分布比例来看，淀粉镉累积量占稻谷镉总量的比例平均为18.34%；蛋白镉累积量所占比例平均为 53.21%；黄淀粉镉累积量所占比例平均为18.83%；废液中镉的累积量所占比例平均为10.37%[12]。可见，大米中的镉富集在蛋白质中，而在淀粉中积累较少，故大米淀粉产品的制备有望成为含镉大米加工利用的有效途径之一。近年的关注点大多聚集于大米镉结合蛋白，鲜有研究乳酸菌发酵对大米淀粉的影响。本实验以乳酸菌发酵降镉后的大米为原料，研究分析了乳酸菌发酵降镉处理对大米淀粉结构和理化性质的影响，为大米低蛋白产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵液(乳酸菌浓度约108～109cfu/mL)，镉含量约0.9 mg/kg的大米(早籼稻，2019年生产，常温储存，市购)，植物乳杆菌(1×1010cfu/g)，盐酸、硫酸、乙醚、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、亚硫酸钠、醋酸铅等化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

K9840半自动凯氏定氮分析仪，JUPITER-B微波消解仪，700P石墨炉原子吸收光谱仪，SpectraMax i3X酶标仪，HAQ-C空气浴振荡器，Q2000差示扫描量热仪，RVA-Super3快速黏度分析仪，Tescan Mira3扫描电子显微镜，Rigaku Ultimate IV X-衍射仪。

1.3 方法

1.3.1 大米发酵降镉工艺

在洁净的塑料桶中依次加入120%的超纯水、0.08‰的植物乳杆菌、2%的米粉发酵液和0.8%的食盐(均以大米质量计)，搅拌均匀后加入一定量的大米，继续搅拌均匀，于32 ℃恒温培养箱内静置发酵20 h。待发酵结束，舍弃上清液，用自来水将发酵米样冲洗4～5遍，沥干，平铺于大培养皿中，于50 ℃鼓风干燥箱中烘干12 h以上。再将干燥完成后的大米进行粉碎后过80目筛，装于密封袋，保存于干燥器中备用。

1.3.2 提取大米淀粉

参照陈青[13]的方法，将镉超标大米进行乳酸菌发酵后作为研究对象，并以未发酵的镉大米作为对照，采用分级提取的方法提取大米蛋白，将提取后的沉淀加入纯水进行水洗离心2次，可见淀粉分为上下两层，其中上层为大米白淀粉，下层为大米黄淀粉，将白、黄淀粉分离开再各自离心水洗3次，并将白淀粉上层淡黄色糊状物质去除，于45 ℃鼓风干燥箱中烘干至少12 h，-粉碎后过80目筛，即可得大米白淀粉和大米黄淀粉，装于密封袋，保存于干燥器中备用。

1.3.3 基本成分测定

根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定蛋白质质量分数；采用DNS法测大米淀粉质量分数，标准曲线为y=0.294x+0.000 3，R2=0.999 8；根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法测定脂肪质量分数；采用水分快速测定仪测定水分含量；用直链淀粉质量分数检测试剂盒测定直链淀粉质量分数：取样品0.01 g，将样品进行脱糖、脱脂并溶解后离心，调节双波长至550 nm和485 nm，离心取上清液测吸光度值，根据试剂盒的相应公式计算直链淀粉质量分数，每个样品做3个平行。

1.3.4 镉含量

参照陈青[13]的方法，采用微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定大米镉含量。

1.3.5 大米淀粉微观结构

参照陈青[13]的扫描电镜方法，将干燥后的大米淀粉通过导电双面胶固定于样品载体片上，气流吹去未稳定黏合的样品，喷镀铂金粉后放置于扫描电子显微镜下观察并拍摄有代表性的颗粒形貌。观察时放大倍率为5 000，压力10.0 kV。

1.3.6 大米淀粉结晶度

在Zhang等[14]方法上稍加修改，取适量大米淀粉放入干燥器中，平衡水分48 h，然后把平衡好水分的大米淀粉放入玻璃片的凹槽内压平，且使样品表面光滑，且与玻璃片表面保持水平。采用石墨单色器，铜靶选用Cu-Ka，管压设置为40 kV，电流为40 mA，发射狭缝为1°，防散射狭缝为1°，接受狭缝为0.3 mm，2θ扫描区间3°～50°，扫描速度2°/min。得到的结果通过Origin 2020软件作图并用JADE 9.0软件进行结晶度的计算。

1.3.7 大米淀粉热特性

在Zhang等[14]方法上稍有改变。在铝DSC坩埚中称2 mg样品(干基质量)，然后加入7.5 μL的超纯水形成悬浮液，用压片机对坩埚进行压片密封，室温下平衡2 h。样品升温速率为10 ℃/min(25～100 ℃)，以空密封坩埚为参照。记录4个热参数：起始温度、峰值温度、糊化终止温度和吸热焓。每个样品做3个平行。

1.3.8 大米淀粉糊化特性

参照吕佩霞[15]的测定方法，采用快速黏度测定仪(RVA)测定：以12%含水量为基准，量取(25.0±0.1) mL蒸馏水移入样品筒中，称取(3.00±0.01) g已知含分量的粉碎大米淀粉试样转移到样品筒内的水面上。将搅拌器置于样品筒中，并用搅拌器上浆叶在试样中上下剧烈搅动。再将搅拌器插入样品筒中并将样品筒插接到仪器上，按下塔帽，启动测量循环。设置程序为：起始温度50 ℃，保持1min，然后以18 ℃/min速率升温到95 ℃，保持2.5 min，然后温度再以12 ℃/min的速率降至50 ℃，保持1 min。测试结束后，取下样品简。总共大约13 min，得到糊化特性曲线，记录其峰值黏度、热糊黏度、崩解值、最终黏度、回生值和糊化温度。每个样品做3个平行。

1.3.9 大米淀粉溶解度与膨胀力

参照陈季旺等[16]方法，将干燥皿于105 ℃下烘干至恒重(m0)，将使用前的50 mL干燥离心管称重(y0),取0.5 g大米淀粉于50 mL离心管中，加入25 mL超纯水，混匀30 s，在室温静置平衡5 min，再放入恒温空气浴振荡器中60 ℃，180 r/min，振荡30 min后，取出放于冰水中冷却1 min，于室温冷却平衡5 min，用离心机3 000 r/min，20 min，24 ℃进行离心分层，取出后，将上清液倒入恒重的干燥皿中，于105 ℃烘干至恒重后称重(m1)，将离心后有沉淀物的离心管进行称量(y1)，每个样品3个平行，计算溶解度(s%)和膨润力(sp)。

(1)

(2)

式中：m为样品质量：w为样品含水量。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行平均值、ANOVA方差分析及显著性分析，并用Origin 2020软件绘图。

2 结果与结论

2.1 基本成分

从表1(均以干基计)可以看出，原料大米的淀粉质量分数高达91.43%，蛋白含量和脂肪质量分数都较低，发酵后，大米的基本成分含量均有所下降，淀粉质量分数仍然高达91.35%，故该镉超标大米在发酵前后均适宜提取大米淀粉，发酵后的大米镉含量明显下降，乳酸菌发酵镉消减率达75.4%。从表2(均以干基计)可以看出，大米白淀粉、大米黄淀粉的直链淀粉质量分数经发酵后均下降，黄淀粉的蛋白质质量分数高于白淀粉，且镉含量较高，印证了大米中的镉主要与蛋白质结合[17，18]。

表1 原料大米和发酵大米基本成分

表2 大米淀粉基本指标

2.2 乳酸菌发酵降镉对大米白、黄淀粉微观结构的影响

如图1所示，原料白淀粉颗粒大体呈平滑的不规则的多边形和球形，淀粉直径大约3～8 μm，有少量小块的淀粉颗粒，少量纤维素或者蛋白质附着在淀粉颗粒上，淀粉颗粒表面较光滑。且有少数淀粉里上有裂纹、凹痕和小孔，说明碱提的方式会对淀粉颗粒有轻微的损害。发酵后的大米白淀粉小颗粒较未发酵前的白淀粉增多，淀粉直径约3～8 μm，其表面附着极少的纤维素和蛋白质，且淀粉颗粒上还有凹槽、小孔、裂纹等较未发酵白淀粉加重，部分淀粉颗粒不完整，说明在乳酸菌发酵降镉的过程中，蛋白质可能从与淀粉的包裹结构中释放出来[13]。

图1 原料和发酵米白、黄淀粉扫描电镜图(5 000倍)

原料黄淀粉颗粒大小比较均匀，淀粉颗粒直径在3～8 μm，淀粉颗粒大体呈现不规则的多面形和球形，大部分淀粉表面平滑，少数淀粉颗粒上有小洞及凹痕及破损，与白淀粉相比较，黄淀粉表面附着的纤维素网和蛋白质。发酵后，黄淀粉颗粒直径2～10 μm，淀粉颗粒表面凹痕、小孔、裂纹较未发酵黄淀粉增多，小颗粒淀粉增多，且淀粉表面黏附着纤维素和蛋白质，使颗粒表面变得不平滑，颗粒完整性被破坏。整体来看，乳酸菌发酵降镉不仅在米粒表面进行，在米粒内部对大米中的白、黄淀粉都有轻微的损害[6,19]。但大米淀粉的整体结构未被破坏，表明乳酸菌发酵降镉对淀粉的损害程度低，这对开发淀粉类产品是有利的[20]。

2.3 乳酸菌发酵降镉对大米白、黄淀粉结晶度的影响

如图2所示，发酵前后的白、黄淀粉颗粒在衍射角度2θ为15.3°、17.1°、18.2°和23.5°上有明显的衍射峰，峰位未发生明显偏移，均属于标准的A型结晶体，与具有典型A型结晶结构的正常籼米晶体相比，镉超标大米在发酵前后，大米白、黄淀粉的晶体结构没有改变。

图2 原料米和发酵米的白、黄淀粉衍射图

淀粉颗粒中包含结晶区和无定形区，结晶区主要由支链淀粉外链与直链淀粉组成的双螺旋结构构成[21]。从表3可以看出，原料白淀粉结晶度为43.40%，黄淀粉的结晶度为43.03%；发酵白淀粉结晶度为36.82%，黄淀粉的结晶度为38.24%；镉超标大米经过乳酸菌发酵降镉后白淀粉和黄淀粉的结晶面积均减少。从表2中可以看出，发酵后大米白淀粉和黄淀粉的直链淀粉质量分数均减小，说明发酵降镉使淀粉的直链淀粉质量分数减小，使得由支链淀粉外链与直链淀粉构成的非结晶区增加，结晶区减少，从而导致发酵后淀粉结晶度下降，使宏观品质发生细微改变[5,22]，表明淀粉结晶度与直链淀粉质量分数和结构有关，且直链淀粉质量分数与结晶度呈正相关，这与Kong等[23]研究结论相反。另一方面，淀粉颗粒的裂纹也可能导致结晶度的丧失，结晶区结构较松散，使结晶面积减少[24]，这与上述扫描电镜的分析相符。

表3 原料米和发酵米白、黄淀粉的X射线衍射结晶结构

2.4 乳酸菌发酵降镉对大米白淀粉、大米黄淀粉热特性的影响

从表4中可以看出，乳酸菌发酵降镉后的大米白、黄淀粉的糊化开始温度高于镉超标大米白、黄淀粉，说明经过乳酸菌发酵降镉后的大米白、黄淀粉不易糊化。发酵降镉后的大米白、黄淀粉吸热焓也比镉超标大米的低，吸热焓表示的是淀粉结构从有序转变到无定形所需的能量。有研究表明，经过乳酸菌发酵降镉后的大米的热特性与正常籼米的相似，具有不易糊化和吸热焓低等特点，发酵后吸热焓降低与淀粉的结晶度减小有关，需要转化的结晶区减少，所需能量也减少[15]。从整体来看，黄淀粉的峰值温度和糊化终止温度均高于白淀粉，其中峰值温度差异与淀粉-蛋白结合体是否被破坏有关，由于黄淀粉中有更多的蛋白体黏附在淀粉颗粒四周，阻止了糊化过程中水分的进入，于是需要更多的初始能量来破坏这一结合体，故黄淀粉的峰值温度高；而糊化终止温度差异可能与黄淀粉中淀粉-蛋白结合体更多相关，这影响了米粒中的脂类同淀粉颗粒中直链淀粉复合物的形成，从而导致糊化终止温度的下降[25]。

表4 原料米和发酵米白、黄淀粉的DSC结果分析表

2.5 乳酸菌发酵对大米白、黄淀粉糊化特性的影响

从表5可以看出，乳酸菌发酵降镉后，大米白、黄淀粉的糊化温度和达到峰值黏度的时间较原料淀粉增加，峰值黏度较原料淀粉减少，说明发酵后更不易糊化，这与DSC的结果一致，一方面可能与发酵后直链淀粉质量分数增加，导致淀粉颗粒分子结构改变有关；另一方面可能与发酵后淀粉颗粒崩解值减小，使淀粉更加稳定有关。回生值主要体现的是淀粉受热冷却后老化的难易程度，可以看出乳酸菌发酵降镉促进了白淀粉的回生，使其更易老化，抑制了黄淀粉的回生，使其更不易老化，可能与镉大米陈放时间过久有关。从整体来看，黄淀粉的回生值显著高于白淀粉，这可能与淀粉中的蛋白质质量分数有关[11]。崩解值与淀粉的耐剪切性能呈负相关关系，发酵降镉后，大米白、黄淀粉的崩解值较原料淀粉下降，说明发酵降镉使淀粉稳定性更强，且白淀粉的崩解值显著高于黄淀粉，说明蛋白质质量分数高，其与淀粉之间的相互作用，使崩解值减小[26]。发酵降镉使淀粉的最终黏度稍有降低，说明发酵对大米品质有所改善[18]，而发酵降镉对大米白、黄淀粉的最低黏度没有较大影响。

表5 原料米和发酵米淀粉的RVA特性分析表

2.6 乳酸菌发酵降镉对大米白、黄淀粉溶解度和膨润力的影响

从表6中可以看出，发酵降镉后，镉大米白淀粉和黄淀粉的溶解度和膨润力都有小幅度的增加。溶解度主要反应的是在一定温度下淀粉与水的结合力[27]，说明镉大米经过乳酸菌发酵降镉后，在60 ℃下，大米白、黄淀粉更易与水结合。膨润力主要发生在无定形区，反应的是直链淀粉的水合作用[28]，说明镉大米经过乳酸发酵降镉，直链淀粉质量分数减小，形成的结晶区减小，结晶度减小，无定形区增加，直链淀粉对淀粉颗粒的抑制作用减小，淀粉粒之间结合变松，所以膨润力增加，这与前面的淀粉X射线衍射结果相符。

表6 原料米和发酵米白、黄淀粉溶解度和膨润力的变化

3 结论

在本实验中，乳酸菌发酵降镉率达到75.4%，发酵降镉后，大米基本成分含量均有所降低。乳酸菌发酵降镉不仅发生在大米颗粒表面，也深入了颗粒内部：对大米白淀粉、大米黄淀粉颗粒表面结构均有一定的改善；大米白、黄淀粉的晶型都为A型，结晶度降低；糊化初始温度增加，吸热焓降低，这与正常籼米的热特性相似；糊化温度和峰值时间的增加、崩解值的减小，这表明发酵后不易糊化；溶解度和膨润力均有小幅度增加，这与淀粉的结晶度趋势相符。这不仅为微生物发酵降镉的机理提供了更细致的理论基础，也为进一步研究利用大米淀粉制作低蛋白产品提供参考。