D-D、PD-1/PD-L1、miR-16与肝癌经导管肝动脉化疗栓塞术治疗反应性的关系及预测术后复发的效能研究

朱 勇，鲁正学，侯 婧

经导管肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)可通过栓塞靶血管引起肿瘤组织缺血坏死，是肝癌重要的微创介入策略；但不同患者治疗反应性不同，其中未获缓解及治疗后复发成为影响预后主要因素；因此准确评估肝癌TACE患者治疗反应性，早期预测TACE后复发风险对指导临床决策、调整治疗方案等意义重大[1]。D-二聚体(D-D)在原发性肝癌患者中水平显著高于健康对照者，并与预后有关[2-3]。程序性死亡受体-1(PD-1)/程序性死亡受体-配体1(PD-L1)及其介导的协同刺激信号参与机体免疫调控网络，与肝癌癌细胞恶性生物学行为有关，可能参与了肝癌发病、进展[4-5]。微小RNA-16(miR-16)过表达能通过阻断Wnt/β-catenin信号通路，抑制肝癌细胞的生长与侵袭[6]。目前关于D-D、PD-1/PD-L1、miR-16与肝癌TACE治疗反应性的关系及联合预测TACE后复发的报道鲜见，本研究对此进行探讨，以期为临床肝癌的治疗和预后评估提供参考。

1 资料和方法

1.1临床资料 选取2017年4月—2020年5月我院收治行TACE治疗的169例肝癌为研究对象。纳入标准：符合原发性肝癌诊断标准[7]；行TACE治疗者；肝功能Child-Pugh分级A或B级；TACE前无肝癌相关治疗；患者知晓本研究，自愿签署知情同意书。排除标准：白细胞<3×109/L；有出血倾向者；严重腹水者；门静脉主干完全栓塞者；肾功能严重不全者；严重黄疸者；碘过敏者；急性感染者；血液系统疾病者；其他原发性恶性肿瘤者。本研究获我院伦理委员会审核通过。TACE治疗后完全缓解55例，部分缓解38例，稳定61例，进展15例。根据治疗反应性分为缓解组93例和非缓解组76例。缓解组男50例，女43例；年龄(62.28±11.47)岁；病因：病毒性肝炎75例，酒精性肝炎12例，其他6例；肝功能Child-Pugh分级：A级79例，B级14例；并发症：门静脉高压6例，轻度腹水4例；体质量指数(24.16±1.76)kg/m2；既往病史：高血压病5例，糖尿病9例，冠心病4例；临床分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期59例，Ⅲ期32例。非缓解组男34例，女42例；年龄(65.09±10.56)岁；病因：病毒性肝炎66例，酒精性肝炎7例，其他3例；肝功能Child-Pugh分级：A级69例，B级7例；并发症：门静脉高压1例，轻度腹水2例；体质量指数(23.97±2.41)kg/m2；既往病史：高血压病2例，糖尿病4例，冠心病1例；临床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期53例，Ⅲ期22例。2组性别、年龄、体质量指数等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1治疗方法：所有患者均接受TACE微创介入治疗。仰卧位，局部麻醉，Seldinger技术穿刺右股动脉，置入5F导管鞘，插5F RH肝管至肝总动脉实施造影，观察肿瘤位置、数量、范围、供血动脉，2.7F微导管选择至供血动脉，注入化疗药物，将超液化碘油与表柔比星10～20 mg混合后栓塞肿瘤靶血管，待局部小门静脉显影或瘤体碘油沉积较密时停止注入，酌情加用吸收性明胶海绵或聚乙烯醇栓塞颗粒。之后给予保肝、护胃、能量支持、止吐等对症处理，每个治疗周期为4～6周，共治疗2个周期。

1.2.2各指标检测：TACE前采集所有患者外周血5 ml，采用免疫层析法检测血浆D-D水平，采用流式细胞仪检测CD4+、CD8+ T细胞表面PD-1、PD-L1水平，采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测血清miR-16水平。

1.2.3疗效评估：完成治疗周期后1个月，参考实体瘤疗效评估标准[8]评估疗效，完全缓解和部分缓解纳入缓解组，稳定和进展纳入非缓解组，并随访3个月统计复发情况。完全缓解复发标准是出现新的病灶，部分缓解、稳定复发标准是在TACE后出现新的进展。比较2组及复发、未复发患者D-D、PD-1/PD-L1通路指标、miR-16水平，分析D-D、CD8+PD-L1、miR-16水平与治疗反应性相关性及复发的相关影响因素，并分析各指标预测复发效能。

2 结果

2.1缓解期与非缓解期组D-D、PD-1/PD-L1通路指标、miR-16水平比较 2组CD4+PD-1、CD8+ PD-1、CD4+ PD-L1水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。缓解组CD8+ PD-L1、D-D低于非缓解组，miR-16高于非缓解组(P<0.05)。见表1。

表1 缓解组与非缓解组原发性肝癌D-D、PD-1/PD-L1通路指标、miR-16比较

2.2D-D、CD8+ PD-L1、miR-16水平与治疗反应性关系 D-D、CD8+ PD-L1水平与治疗反应性呈负相关(r=-0.822、-0.742，P<0.01)，miR-16水平与治疗反应性呈正相关(r=0.716，P<0.01)。见图1。

图1 D-D、CD8+ PD-L1、miR-16与原发性肝癌治疗反应的相关性分析

2.3复发与未复发患者D-D、PD-1/PD-L1通路指标、miR-16比较 由于TACE后病情进展患者无法评估复发与否，故不纳入数据统计，仅纳入完全缓解、部分缓解、稳定共154例。随访3个月3例失访，将获访患者中复发22例为复发组，未复发129例为未复发组。与未复发组比较，复发组D-D、CD8+ PD-L1水平增高，miR-16水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 复发与未复发原发性肝癌D-D、PD-1/PD-L1通路指标、miR-16水平比较

2.4原发性肝癌复发因素分析 以复发情况作为因变量，0=未复发，1=复发。纳入D-D、CD8+ PD-L1、miR-16指标作为自变量，赋值分别为：D-D≤128.33 μg/L=1，>128.33 μg/L=2；CD8+ PD-L1≤31.18%=1，>31.18%=2；miR-16≤1.02=1，>1.02=2。参考各连续变量均值进行分层，将D-D、CD8+ PD-L1、miR-16转化为二分类变量，应用非条件Logistic回归方程分析，结果显示D-D>128.33 μg/L、CD8+ PD-L1>31.18%、miR-16>1.02是原发性肝癌TACE后复发的危险因素(P<0.01)。见表3。

表3 影响原发性肝癌TACE治疗后复发的多因素Logistic回归分析

2.5D-D、CD8+ PD-L1、miR-16对复发的预测 以复发患者D-D、CD8+ PD-L1、miR-16为阳性样本，以未复发患者D-D、CD8+ PD-L1、miR-16为阴性样本，绘制各指标预测TACE后复发的ROC，结果显示D-D、CD8+ PD-L1、miR-16预测原发性肝癌TACE后复发AUC依次为0.774、0.842、0.831；采用SPSS软件联合应用ROC理论模式(LogP模式：对各单独应用指标进行综合回归，建立Logistic预测评估模型)，结果显示D-D、CD8+ PD-L1、miR-16三者联合预测TACE后复发的AUC为0.931。见图2、表5。

表5 D-D、CD8+ PD-L1、miR-16水平对原发性肝癌TACE治疗后复发的预测

图2 D-D、CD8+ PD-L1、miR-16对原发性肝癌TACE治疗后复发的预测ROC曲线

3 讨论

目前评估原发性肝癌TACE治疗反应性及TACE后复发的方法较少。D-D是纤维蛋白经过活化和水解产生的特异性降解产物之一，可用于评估机体是否存在高凝状态和继发性纤维蛋白溶解亢进[9]。既往资料显示，肝癌介入治疗前D-D高于健康体检者，且介入治疗后有效者D-D降低，并低于无效者[10]。本研究结果显示，缓解组D-D低于非缓解组，且D-D与原发性肝癌治疗反应性呈负相关，提示D-D与原发性肝癌TACE治疗反应性有关，D-D水平较低患者从TACE治疗中获益的可能性较大。恶性肿瘤患者血浆D-D水平升高，与肿瘤细胞表达促凝活性物质和肿瘤细胞释放一些细胞因子，激活了血小板、单核细胞、血管内皮细胞，使凝血功能增强有关；且肿瘤细胞合成纤溶酶原激活物，作用于纤溶酶原，从而导致D-D水平升高[11-12]。D-D水平越高，肝癌病情越严重，TACE根治性难度越大，因此检测D-D可评估TACE治疗反应性。本研究结果显示，复发组D-D高于未复发组，检测D-D预测原发性肝癌TACE后复发的AUC为0.774，提示进行D-D检测可指导临床针对性干预，改善预后。

TACE为经导管肝动脉化疗栓塞术，PD-L1为程序性死亡受体-配体1，D-D为D-二聚体，miR-16为微小RNA-16，ROC为受试者工作特征

肿瘤细胞免疫逃逸和异常细胞信号通路参与了原发性肝癌的发病[13-14]。CD8+ T淋巴细胞被诱导凋亡是肿瘤免疫逃逸的一个重要机制[15]。PD-1/PD-L1是细胞免疫信号传导通路中的信息分子，能通过耦联结合诱导CD8+ T淋巴细胞凋亡，促进肿瘤免疫逃逸[16]。本研究结果显示，缓解组CD8+ PD-L1低于非缓解组，与程小珍等[17]报道相似，提示CD8+ PD-L1与TACE疗效有关。PD-1与PD-L1作用后，可抑制T细胞的增殖和活化，抑制机体对肿瘤细胞的免疫应答，CD8+ PD-L1水平较高患者，肿瘤细胞能逃离宿主的免疫监视和杀伤，呈现出更强的增殖性，因此PD-1/PD-L1成为近年来肿瘤领域研究的热点。本研究结果同时显示，CD8+ PD-L1与原发性肝癌TACE治疗反应性、复发有关，可见阻断PD-1/PD-L1信号通路，可促进机体对肿瘤的免疫监视和杀伤，可能有利于原发性肝癌TACE疗效和预后的改善，有望成为新型、有效的靶分子。CD8+ PD-L1预测TACE后复发的AUC为0.842，当CD8+ PD-L1>39.36%时，有足够的阳性证据预测复发，故应进一步加强监测随访和综合干预。

miR-16定位人染色体13q14上，可促进肿瘤细胞凋亡，该基因区域的缺失与肝癌等多种实体肿瘤发病有关[18]。目前关于miR-16与肝癌TACE治疗反应性、复发关系的报道鲜见。本研究结果显示，缓解组miR-16水平高于非缓解组，与治疗反应性呈正相关，表明TACE治疗前，miR-16水平越高，原发性肝癌患者从TACE获益可能性越大。核因子-κB是miR-16的靶基因之一，而抑制核因子-κB已被证实与肝癌的转移和侵袭有关，故miR-16可能是通过调控核因子-κB影响原发性肝癌TACE后治疗反应性和复发的[19-21]；但缺乏更多相似报道的论证，这一结论及miR-16影响原发性肝癌TACE治疗反应性是否还有其他机制，仍需后续的进一步验证。同时复发组miR-16低于未复发组，且miR-16预测复发的AUC为0.831，呈现出一定应用价值，能为临床预测TACE后复发提供客观数据参考。

综上所述，D-D、PD-1/PD-L1、miR-16与原发性肝癌TACE治疗反应性及TACE后复发有关，当D-D>153.38 μg/L、CD8+ PD-L1>39.36%、miR-16≤0.91时，能为临床预测原发性肝癌TACE后复发提供客观、量化的数据。