右美托咪定对神经胶质瘤细胞PTEN/Akt/mTOR介导自噬及放疗敏感性的影响

彭 湃，杨 军，罗 琴，邱 勇

神经胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤，易扩散至脑组织，具有高度异质性和侵袭性，单纯手术难以根治性切除，放化疗成为其常见治疗方式；但放疗不敏感可导致局部放疗失败，因此，研究神经胶质瘤放疗不敏感机制，寻找提高放疗敏感性药物对该病的治疗具有重要意义[1-2]。右美托咪定(DEX)是一种α2-肾上腺受体激动剂，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等生物学活性作用[3]。蔡明林等[4]报道，DEX可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移, 作用机制可能与抑制第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路激活有关，但DEX对神经胶质瘤细胞的放疗不敏感作用机制尚不清楚。

自噬是一种溶酶体依赖性降解途径，在参与细胞生长分化、维持细胞内环境稳定等过程中发挥重要作用。研究表明，激活肿瘤细胞自噬，可增强肿瘤细胞放疗敏感性[5]。PTEN/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对肿瘤细胞增殖、迁移、自噬、放疗耐受等具有重要作用[6-7]。杨永祥等[8]报道，抑制PTEN的表达，Akt、mTOR的磷酸化水平升高，可增加创伤性脑损伤大鼠海马区神经干细胞增殖能力，表明PTEN/Akt/mTOR信号通路与神经细胞的增殖有关。本研究探究了DEX对神经胶质瘤U251细胞自噬与放疗敏感性影响，明确分子作用机制，旨在为神经胶质瘤的放疗增敏提供一定参考。

1 材料与方法

1.1实验细胞、试剂及仪器 神经胶质瘤U251细胞(批号XLD-2020013)购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所；DEX(批号090119，规格2 ml:0.2 mg)购自江苏恩华药业股份有限公司；二甲基亚砜(DMSO，批号D8371)、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(批号CA1027)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒(批号F5013)均购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM培养液(批号G1037)、胎牛血清(批号G6113)均购自美国Gibco公司；BCA试剂盒(批号P0042)、ECL试剂盒(批号ST1297-10)、RIPA裂解液(批号P0125F)、硝酸纤维素膜(批号SF1917)均购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗人微管相关蛋白1轻链3(LC3，批号sc-430752)、自噬相关蛋白(Beclin-1，批号sc-141273)、PTEN(批号sc-305572)、Akt(批号sc-20983)、p-Akt，(批号sc-20987)、mTOR(批号sc-713395)、p-mTOR(批号sc-713340)、β-肌动蛋白(β-actin，批号sc-11004)抗体及兔抗人二抗(批号sc-10007)均购自美国Santa Cruz公司；371型二氧化碳(CO2)恒温培养箱、Multiskan GO型酶标仪和E-Gel Imager型凝胶成像仪均购自美国Thermo公司；FACSCantoⅡ型流式细胞仪购自美国BD Biosciences公司。

1.2细胞培养 将神经胶质瘤U251细胞活化后，用含有10%胎牛血清、青霉素与链霉素各1×105U/L的DMEM培养液，在37℃恒温、5% CO2培养箱中培养，隔天换液1次，待80%细胞贴壁融合时，0.25%胰酶消化，取对数期细胞进行后续实验。

1.3MTT法检测DEX对细胞增殖的影响 取对数生长期U251细胞，调整细胞浓度为每毫升2×106个，将细胞接种于96孔板中，培养过夜，分别加入终浓度为5、10、25、50、100、200、500 ng/ml的DEX，另设对照组(不加DEX处理)，每组均设6个复孔，继续培养24、48 h。每孔加入20 μl的MTT溶液(浓度为0.5 mg/L)，培养4 h后，加入200 μl的DMSO，用全自动酶标仪测量490 nm处的光密度(OD)值。

1.4细胞放疗处理 将培养板置于照射野(20 cm×20 cm)内，细胞板上放置1.5 cm硅胶补偿膜，采用6 MV直线加速器X射线进行照射，直线加速器6 MV-X线照射，吸收剂量率为250 cGy/min，总照射剂量分别为 0、2、4、6、8 Gy。

1.5克隆形成实验 放疗组给予0、2、4、6、8 Gy剂量的X射线照射处理；DEX+放疗组给予10 ng/ml DEX和0、2、4、6、8 Gy剂量的X射线照射处理。DEX+放疗组在照射前采用DEX培养48 h，放射处理后，更换新鲜培养液，继续培养10 d，每3天更换培养基，观察克隆形成情况，当培养板中出现集落形成时，弃去培养液，PBS缓冲液洗涤，多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，计算细胞克隆形成率，克隆形成率=(菌落形成数/接种细胞数)×100%。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 实验分为对照组、放疗组(6 Gy剂量射线处理)、DEX组(10 ng/ml DEX处理)、DEX+放疗组(10 ng/ml DEX+6 Gy剂量射线联合处理)。细胞照射前采用10 ng/ml DEX培养48 h，再用6 Gy剂量的X射线照射处理，各组细胞培养 48 h，采用Annexin V-FITC 和PI溶液避光染色10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.7蛋白免疫印迹法检测细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin-1及PTEN/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达 按照1.6的分组，细胞培养48 h后，4℃条件下加RIPA裂解液处理各组细胞，抽提总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白含量，取50 μg蛋白并加入5×上样缓冲液，100℃沸水浴5 min，-20℃保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶上的目的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，50 g/L的脱脂牛奶室温封闭1.5 h，加入一抗(LC3、Beclin-1、PTEN、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin)(稀释比均为1∶1000)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶3000)，室温孵育2 h，PBS缓冲液洗涤，ECL显影液显色，用凝胶成像系统拍照并分析各蛋白相对表达量。

2 结果

2.1DEX对U251细胞增殖的影响 与DEX浓度0 ng/ml时比较，5、10、25、50、100、200、500 ng/ml DEX处理U251细胞24、48 h的OD值均降低(P<0.05)。经计算DEX处理U251细胞24 h半数抑制浓度(IC50)约为50 ng/ml，后续实验采用20%×IC50为研究浓度，即10 ng/ml。见表1。

表1 不同浓度DEX处理后U251细胞不同时间点的OD值比较

2.2DEX对U251细胞放疗克隆形成率的影响 与放疗组0 Gy时比较，放射剂量2、4、6、8 Gy时U251细胞克隆形成率明显降低，且与放疗剂量增加相关(P<0.05)。与 DEX+放疗组0 Gy比较，放射剂量2、4、6、8 Gy的U251细胞克隆形成率明显降低，且与放疗剂量增加相关(P<0.05)。DEX+放疗组各放射剂量U251细胞克隆形成率均低于放疗组同剂量，其中10 ng/ml DEX和6 Gy放射剂量联用后，能够明显增加对U251细胞的放疗敏感性(P<0.05)。见表2。因此，本研究采用10 ng/ml的DEX与6 Gy放射剂量联合处理进行后续实验。

表2 DEX对U251细胞放疗克隆形成率影响

2.3DEX对U251细胞放疗凋亡的影响 4组细胞凋亡率分别为：对照组(3.63±0.09)%、放疗组(15.64±1.58)%、DEX组(24.32±1.69)%、DEX+放疗组(36.35±2.18)%。放疗组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05)；DEX+放疗组细胞凋亡率高于放疗组(P<0.05)。见图1。

图1 流式细胞仪检测4组U251细胞凋亡情况

2.4DEX对自噬蛋白LC3、Beclin-1蛋白表达的影响 与对照组比较，放疗组、DEX组和DEX+放疗组LC3、Beclin-1蛋白表达水平均升高(P<0.05)；与放疗组比较，DEX+放疗组LC3、Beclin-1蛋白表达水平均升高(P<0.05)。见图2、表3。

图2 4组细胞LC3、Beclin-1蛋白免疫印迹图

表3 DEX对U251细胞自噬蛋白LC3、Beclin-1蛋白表达的影响

2.5DEX对神经胶质瘤细胞PTEN/Akt/mTOR通路相关蛋白的影响 与对照组比较，放疗组、DEX组和DEX+放疗组PTEN蛋白水平升高，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05)。与放疗组比较，DEX+放疗组PTEN蛋白水平升高，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05)。见图3、表4。

图3 4组神经胶质瘤细胞PTEN/Akt/mTOR通路相关蛋白免疫印迹图

表4 DEX对神经胶质瘤细胞PTEN/Akt/mTOR通路相关蛋白的影响

3 讨论

DEX具有镇静、镇痛、抗焦虑、抗交感及减弱应激等多重作用，临床上常用于神经系统的镇定[9]。近年研究表明，DEX能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移，诱导细胞凋亡[10]。本研究结果显示，5～500 ng/ml的DEX对神经胶质瘤U251细胞的增殖均有抑制作用，且随DEX浓度增大，对U251细胞抑制作用增强，经计算DEX对U251细胞IC50约为50 ng/ml。文献报道，放射增敏剂较小剂量即有放射增敏的作用，但增敏剂本身对肿瘤组织作用不强[11]，因此选用IC50的20%进行增敏实验。本试验发现，分别使用放射剂量为2、4、6、8 Gy的X射线处理U251细胞后，细胞克隆形成率降低，与DEX联合处理后，U251细胞克隆形成率明显降低；与放疗组比较，DEX与6 Gy放射剂量联合处理，细胞克隆形成率明显降低，细胞凋亡率增加，能够明显增加对U251细胞的放疗敏感性，然而其具体作用机制尚不清楚。

自噬广泛存在于真核生物中，维持细胞内稳态和生长发育，对肿瘤细胞有双刃剑的作用，具有促存活及凋亡的作用，并且能够影响肿瘤的抗放疗损伤能力[12]。LC3是自噬小体标志蛋白，Beclin-1 是抑癌基因表达的产物，二者均是自噬相关标志物[13-14]。本研究结果显示，与对照组比较，放疗组LC3、Beclin-1蛋白水平均显著升高，提示放疗能诱导U251细胞的自噬；与放疗组比较，DEX+放疗组LC3、Beclin-1蛋白水平均显著升高，提示DEX可增加放疗对神经胶质瘤细胞自噬作用。

PI3K/Akt通路是细胞内重要的信号传导通路，PTEN通过调控PI3K/Akt通路去磷酸化，发挥抑制肿瘤的功能[15]。Akt/mTOR通路是调控自噬的经典通路，mTOR是一种自噬激活剂，抑制mTOR途径可激活自噬，Akt是其上游的调控分子，Akt磷酸化可激活下游通路[16-17]。研究表明，在放射低敏感性食管鳞状细胞癌中，抑制Akt的磷酸化，可增加肿瘤细胞放疗敏感性[18]。何娟等[19]报道DEX能够抑制胶质瘤细胞内Akt信号通路抑制胶质瘤细胞U251体外恶性生长和侵袭。本研究结果显示，与对照组比较，放疗组PTEN蛋白水平显著升高，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平均显著降低；与放疗组比较，DEX+放疗组PTEN蛋白水平显著升高，Akt、mTOR蛋白磷酸化水平均显著降低，提示DEX与放疗联合作用时可抑制PTEN/Akt/mTOR信号通路的活化。

综上所述，DEX可能通过抑制PTEN/Akt/mTOR通路，诱导神经胶质瘤U251细胞发生自噬，增加U251细胞放疗的敏感性。