柚皮素上调锌指蛋白36表达对下咽癌FaDu细胞增殖、侵袭的影响

李文建， 陈 坤

近年，下咽癌发病率有明显升高趋势，约占头颈部肿瘤的5%，主要以鳞状细胞癌为主[1]。手术切除联合药物化疗或放疗是下咽癌当前最为有效的治疗手段。但下咽癌结构特殊，发病隐匿且具有高侵袭性，更易局部侵袭并转移到远处器官，5年生存率为25%～35%[2-3]。如何控制癌细胞侵袭、转移，是有效降低病死率的关键。

锌指蛋白36(ZFP36)可以控制信使RNA 3' 端非翻译区的ARE活性，从而影响信使RNA的稳定及蛋白质的表达；其作为一种调控因子，具有原癌基因或抑癌基因作用，可影响细胞的生物学特性；与胃癌、结肠癌的生长、侵袭和转移密切相关[4]。柚皮素是一种广泛分布在水果、蔬菜和茶中黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗凋亡等生物学活性。上皮-间质转化(EMT)是肿瘤侵袭和转移的关键因素[5]。癌症的发生发展涉及癌细胞增殖、侵袭和转移等多种信号通路异常。STAT3信号通路与多种癌细胞增殖、凋亡和侵袭密切相关。本研究探讨柚皮素对ZFP36蛋白、STAT3信号通路相关蛋白及对下咽癌FaDu细胞增殖、侵袭等影响，以期为改善下咽癌临床治疗提供理论基础及潜在的干预靶点。

1 材料和方法

1.1实验材料 下咽癌FaDu细胞株(购于国家实验细胞资源共享平台)；青链霉素(索来宝公司)；RPMI 1640 培养基(美国Hyclone公司)；小牛血清、胰蛋白酶均购自美国Gibco 公司；柚皮素、二甲基亚砜均购自美国sigma公司；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术公司)；脂质体2000(美国赛默飞公司)；Trizol RNA抽提试剂、Rime ScriptTM逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaTM荧光定量PCR 试剂盒(日本Takara 公司)；E-cadherin、vimentin、转录激活因子3(STAT3)、细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)单抗(美国Cell Signaling公司)；化学发光试剂盒、细胞培养箱均购自美国赛默飞公司；7500型荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)。本实验所用引物均由大连宝生物技术有限公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养：将FaDu细胞培养于37℃、5% CO2条件，终浓度为10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中。

1.2.2FaDu细胞增殖能力测定：将培养的FaDu细胞调整为1×104个/ml，接种于96孔培养板，放置培养箱中继续培养，分别加入终浓度为0、10、20、40 μmol/L的柚皮素处理FaDu细胞48 h，按每孔10 μl加入CCK-8试剂，37℃、5% CO2条件下孵育2～4 h，450 nm处测定吸光度。

1.2.3FaDu细胞侵袭能力测定：按照1∶8比例稀释基质胶，包被到Transwell小室底部膜上室面，分别将终浓度为0、10、20、40 μmol/L的柚皮素处理的FaDu细胞加入到Transwell小室，细胞终浓度为5×104个/ml，然后板下室加入含20%小牛血清的培养液600 μl，37℃、5% CO2培养箱中孵育 20～24 h。取出Transwell 小室，经过固定、染色、分化、再染色、脱水及封片，在200倍显微镜下观察并计数。

1.2.4ZFP36+PCR3.1质粒转染后FaDu细胞增殖、侵袭能力测定：待FaDu细胞达到 30%～50%的融合率时，按照脂质体2000试剂盒操作步骤，将ZFP36+PCR3.1质粒、PCR3.1质粒转染入FaDu细胞内，检测转染后细胞增殖和侵袭能力。将细胞分为对照组、PCR3.1质粒组和ZFP36+PCR3.1质粒组。

1.2.5基质金属蛋白酶(MMP)-9和MMP-13 mRNA表达情况：采用荧光实时定量PCR检测。将ZFP36+PCR3.1质粒、PCR3.1质粒成功转染入FaDu细胞后，吸去培养液后磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每孔各加入1 ml TRIzol 试剂，反复吹打细胞，移入去酶EP管中，按照TRIzol试剂盒使用说明提取细胞总RNA，分光光度计检测RNA质量和浓度。反转录过程按照 TaKaRa试剂说明进行操作。取反转录产物 cDNA 进行荧光实时定量PCR检测，过程按照 TaKaRa试剂说明书进行操作。反应条件按照TaKaRa试剂说明进行操作。实验数据通过相对定量ΔΔCt法进行分析。

1.2.6EMT相关蛋白及STAT3信号通路表达情况：采用Western blot检测，将ZFP36+PCR3.1、PCR3.1质粒成功转染入FaDu细胞后，用细胞刮刀将细胞收集到EP管中，加入预冷蛋白裂解液提取蛋白并进行蛋白定量。随后将蛋白样品进行10% SDS-PAGE电泳分离，再以300 mA恒流电转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再加入E-cadherin、vimentin、STAT3、SOCS3等一抗，4℃孵育过夜，次日1×TBS-T洗涤3次，每次5 min，加入辣根酶标记的二抗，室温孵育1 h，再1×TBS-T洗涤3次，每次5 min，ECL化学发光剂发光检测信号。以上实验均重复3次。

2 结果

2.1柚皮素对FaDu细胞增殖、侵袭能力的影响 不同浓度柚皮素处理FaDu细胞48 h后，随着柚皮素浓度增加，细胞增殖活性显著下降，细胞侵过滤膜的数量显著减少(P<0.05)。见图1、2。

图1 不同浓度柚皮素培养条件下FaDu细胞增殖能力

图2 不同浓度柚皮素培养条件下FaDu细胞侵袭能力(HE×200)

2.2柚皮素对ZFP36蛋白表达的影响 随着柚皮素浓度增加，ZFP36蛋白表达水平增加，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 不同浓度柚皮素对ZFP36蛋白表达影响

2.3ZFP36对FaDu细胞增殖、侵袭能力和MMP基因表达的影响 与对照组和PCR3.1组比较，ZFP36+PCR3.1组FaDu细胞增殖活性、侵袭能力、MMP-9和MMP-13 mRNA表达水平均显著下降(P<0.05)。见图4～6。

图4 ZFP36+PCR3.1转染后FaDu细胞增殖能力比较

图5 转染ZFP36+PCR3.1后FaDU细胞侵袭能力(HE×200)

图6 转染ZFP36+PCR3.1后FaDu细胞MMP-9和MMP-13 mRNA表达情况比较

2.4ZFP36对EMT相关蛋白及信号通路表达的影响 与对照组和PCR3.1组比较，ZFP36+PCR3.1组E-cadherin、SOCS3表达上升，vimentin、STAT3表达水平均下降(P<0.05)。见图7、8。

图7 转染ZFP36+PCR3.1后FaDU细胞对EMT相关蛋白的表达影响

图8 转染ZFP36+PCR3.1后FaDU细胞对STAT3和SOCS3蛋白表达水平影响

3 讨论

约50%下咽癌患者就诊时已经出现淋巴结转移，预后较差[6]。如何有效地控制癌细胞增殖及转移，成为临床医生面对的难题。本研究结果显示，柚皮素可以抑制下咽癌FaDu细胞增殖、侵袭，且呈剂量依赖性。提示柚皮素可用于下咽癌的辅助治疗。本研究结果显示，随着柚皮素浓度增加，在FaDu细胞中ZFP36蛋白表达上调。柚皮素抑制FaDu细胞增殖、侵袭可能与ZFP36蛋白表达上调有关，提示ZFP36可能是一种新型柚皮素靶点。ZFP36参与多种肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[7]，在肿瘤发生发展中起着重要的生物学作用。Lee等[8]报道，ZFP36在结肠癌细胞CT26中调控白细胞介素-23 mRNA的表达，ZFP36过表达抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭。Resch等[9]研究发现，ZFP36调控宫颈癌细胞Hela的增殖和凋亡。本课题组将ZFP36+PCR3.1质粒转染入FaDu细胞中后，发现细胞增殖、侵袭被明显抑制，表明ZFP36基因可能是下咽癌细胞增殖、侵袭的关键基因。基质金属蛋白酶(MMP)是一种蛋白酶家族，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9等蛋白酶，可靶向其他蛋白、生长因子及黏附分子[10]。MMP-9和MMP-13高表达与肿瘤预后呈负相关性。Nair等[10]研究证实，过表达MMP-14促进头颈部鳞状细胞癌侵袭和迁移。本研究结果显示过表达ZFP36使MMP-9和MMP-13 mRNA表达水平下降，从而抑制FaDu细胞的增殖和侵袭。

EMT在肿瘤发生过程中也起着重要作用，包括局部侵袭和通过循环系统的远处转移和扩散[11]；其显著特征为细胞间黏附分子和E-cadherin表达下调，而N-cadherin、vimentin和黏连蛋白表达上调。E-cadherin和vimentin在肿瘤组织的侵袭和迁移中起着重要作用[12]。在下咽癌中，E-cadherin表达下调与癌细胞的侵袭、迁移和预后不良有关。本研究结果显示，当FaDu细胞中ZFP36过表达时，vimentin表达下调，E-cadherin表达则上调。同时柚皮素上调ZFP36蛋白表达与STAT3信号通路有关，过表达ZFP36导致STAT3表达显著下降。在正常组织中，STAT3蛋白活化为短暂性、可逆性激活，SOCS3通过负反馈抑制JAK/STAT3信号转导，使活化的STAT3迅速恢复正常状态[13]。在肿瘤组织中，SOCS3蛋白表达异常导致STAT3持续性活化、肿瘤侵袭和转移。SOCS3是抑制STAT3的内源性基因，其通过结合磷酸酪氨酸残基SH2区域或者细胞因子受体来抑制STAT3信号通路[14]。陈宇斐等[15]报道，MCF-7细胞中STAT3蛋白改变，是由于其上游蛋白JAK抑制所导致的。本研究结果显示，在FaDu细胞中，ZFP36可抑制STAT3磷酸化，并上调SOCS3蛋白的表达水平。提示在下咽癌FaDu细胞中，柚皮素诱导的ZFP36蛋白可促进SOCS3表达并抑制STAT3活性。

综上所述，柚皮素可抑制下咽癌FaDu细胞的增殖、侵袭，其通过上调ZFP36表达改变FaDu细胞生物活性。ZFP36可增加SOCS3蛋白表达，下调STAT3表达，为临床治疗下咽癌提供了理论基础。