B7-H6 影响小细胞肺癌凝血状态的初步研究

张秀芹, 王志强, 秦艳, 张芳*

(江南大学 附属医院 1.呼吸科; 2.心胸外科; 3.病理科, 江苏 无锡 214000)

在各种恶性肿瘤中，肺癌已成为人类肿瘤相关死因的首位原因，也是最常见恶性肿瘤.肺癌分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，在肺癌中，SCLC仅占10%～20%，但其恶性度最高，预后最差[1].因SCLC目前治疗手段有限，尤其晚期SCLC，一旦产生化疗耐药，可发生快速进展，因目前无明确有效治疗靶点[2]，故预后极差.如何延长SCLC患者生存期成为目前亟需解决的问题.众所周知恶性肿瘤患者存在凝血功能异常，如血液高凝状态，甚至发生血管栓塞，肿瘤患者血液高凝状态与肿瘤生长、转移、复发等不良预后密切相关，干扰肿瘤高凝状态也成为治疗肿瘤的有效措施之一.最近免疫治疗成为NSCLC研究热点，靶向PD-L1/PD-1并联合化疗已成为NSCLC治疗的一线或二线选择[3-4].但免疫治疗在SCLC的研究关注较少.本研究将从免疫共刺激分子B7-H6和血液高凝状态关系出发，初步探索两者在SCLC中的临床意义，寻找预测SCLC进展的有效标志物.

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

搜集江南大学附属医院胸外科接受手术治疗的41例小细胞肺癌标本及其癌旁1 cm肺组织石蜡标本41例.男33例，女8例，年龄33～78岁，平均61.80岁；搜集手术患者临床及病理资料：D-二聚体、血小板计数、凝血酶原时间及手术标本脉管内血栓发生率.41例小细胞肺癌患者均经术前评估，为无纵膈淋巴结肿大的T1-2N0M0患者，具有明确手术指征.上述病理组织标本的使用均经江南大学附属医院伦理委员会同意.

1.2 研究方法

将石蜡标本切割成4 μm大小组织切片，实施免疫组化.组织切片被转移到黏附载玻片上，在65 ℃烘干30 min，二甲苯中脱蜡，经不同体积分数的乙醇(100%,95%,80%,75%)水化，再加入枸橼酸缓冲液(浓度为10 nmol/L;PH 6.0)100 ℃沸液中进行抗原修复，约30 min.用质量分数0.3%过氧化氢酶溶液阻断内源性过氧化物酶活性约30 min，磷酸盐缓冲液冲洗，加兔抗人B7-H6多克隆抗体(1∶200稀释，Abcam,艾博抗公司)4 ℃过夜，阴性对照用磷酸盐缓冲液代替一抗，最后用辣根标记山羊抗兔二抗(1∶1 000稀释，Merck &Millipore)孵育.

1.3 结果判定

切片通过2名病理科医师进行检查和评价，根据染色程度，B7-H6蛋白表达被定量分析.染色范围评分：0 (0%)、 1 (1%～10%)、 2 (11%～33%)、 3 (34%～66%)、 4 (67%～100%).染色强度评分：0(无染色)，1(弱染色，淡黄色)，2(中等染色，黄褐色)，3(强染色，褐色).根据上述面积和染色强度来确定总分：0(阴性)，1～4(弱阳性)，5～8(中度阳性)，9～12(强阳性)；根据总分确定：B7-H6阴性组(总分≤2)，B7-H6阳性组(总分>2)[5].

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 B7-H6在SCLC手术标本和正常肺组织的表达

应用免疫组化分析41例SCLC和41例癌旁肺组织B7-H6表达情况(表1).在41例SCLC标本中33例(33/41)为B7-H6阳性表达，以中等阳性表达为主，B7-H6表达主要集中在肿瘤细胞的细胞浆和细胞核(图1)，仅发现3例(3/41)癌旁肺组织表达B7-H6弱阳性.可见，SCLC手术标本B7-H6表达高于正常肺组织，两者具有统计学差异(P<0.05).

表1 B7-H6在小细胞肺癌和正常肺组织的表达情况

A：B7-H6在小细胞肺癌中的阳性染色(×400) B：正常对照小细胞肺癌(×400)A: Positive staining at a magnification of SCLC (×400). B: Normal control at a magnification of SCLC (×400)

2.2 B7-H6和凝血指标关系

分析41例SCLC中B7-H6表达和D-二聚体关系，B7-H6阳性组D-二聚体为(0.469 0±0.428 0)mg/L，B7-H6阴性组D-二聚体水平(0.171 5±0.088 2)mg/L，B7-H6阳性组D-二聚体水平高于B7-H6阴性组(P<0.05，表2)；同时分析B7-H6表达和血小板、凝血酶原时间关系，发现B7-H6阳性组血小板平均计数(273.68±114.92)×109/L，B7-H6阴性组血小板计数(193.20±60.69)×109/L；B7-H6阳性组血小板平均计数水平明显高于B7-H6阴性组(P<0.05，表2)，而B7-H6阳性组凝血酶原平均时间(10.34±1.12)s，B7-H6阴性组(11.20±1.09)s，B7-H6阳性组凝血酶原平均时间短于B7-H6阴性组(P<0.05，表2).

表2 B7-H6表达和D二聚体，血小板，凝血酶原时间Table 2 B7-H6 expression and D dimer, platelet, prothrombin time

2.3 B7-H6和脉管内血栓关系

对41例小细胞肺癌临床病理资料进行分析，追访病理医师处理手术标本时脉管内是否存在血栓的记录，结果显示：B7-H6阳性表达组有19例病人发现脉管内存在血栓，B7-H6阴性表达组仅有1例发现脉管内血栓.B7-H6阳性组脉管内血栓发生率高于B7-H6阴性组(P<0.05，表3).

表3 B7-H6表达和脉管内血栓Table 3 B7-H6 expression and intravascular thrombosis

3 讨论

肿瘤免疫成为目前研究和治疗的焦点，其中B7家族备受关注.B7家族包括PD-L1，B7-H2，B7-H3，B7-H4，B7-H6，HHLA2等分子，这些免疫分子通过肿瘤微环境，与肿瘤细胞表面配体相互作用，发生负性调节作用，逃避免疫监视，促进肿瘤进展[6].免疫共刺激分子被发现在多种肿瘤中表达，其中B7-H6是最近被发现B7家族一员，与自然杀伤细胞(NK)表面NKp30受体相互作用，激活NK细胞，产生细胞因子，发挥抗肿瘤效应[7].B7-H6在多种类型肿瘤组织中表达.在乳腺癌组织B7-H6高表达，B7-H6促进乳腺癌进展[8]；在卵巢癌中，B7-H6表达与卵巢癌转移状态和分期有关，B7-H6低表达的病人总生存率高于B7-H6高表达的病人，B7-H6参与肿瘤进展[9].在肝癌组织也发现B7-H6表达水平与肝癌病人生存时间呈负相关[10].可见，B7-H6参与肿瘤进展，与肿瘤患者预后有关.然而，B7-H6在SCLC中的研究较少，我们研究发现B7-H6在SCLC中高表达，且发现B7-H6阳性的SCLC患者，发生脉管血栓的病例数明显高于B7-H6阴性组.

众所周知，实体肿瘤易发生血液高凝状态，其中肺部和胃肠道恶性肿瘤病人具有较高发生血栓风险，已成为肿瘤第二并发症，与肿瘤患者不良预后有关[11-12].在NSCLC术前血浆D-二聚体水平可作为NSCLC手术患者重要预后生物标志物[13].肿瘤细胞通过促进肿瘤血管生长、增加侵袭性及促进静脉血栓形成等一系列过程来促进肿瘤进展和转移，血浆D-二聚体升高增加肿瘤侵袭性，增加癌症患者死亡风险，降低总体生存率[14].血小板除参与止血和促进伤口愈合外，还与肿瘤生长、转移等过程密切相关.Monika和Kanikarla等人[15-16]指出血小板不仅在血液循环系统作为旁观者细胞，而且参与肿瘤生长和转移过程，在肿瘤微环境中直接与肿瘤细胞相互作用，保护血液循环中的肿瘤细胞免受免疫系统和凋亡刺激信号攻击，帮助循环于血液中的肿瘤细胞附着于内皮，促进肿瘤转移.血小板还与循环中的肿瘤细胞相互作用，导致血小板释放细胞因子、血小板活化，促进肿瘤细胞存活和进展，靶向血小板活化治疗策略可抑制肿瘤进展和转移.NSCLC患者存在凝血功能异常，凝血酶原异常也会影响NSCLC不良预后.凝血酶原时间主要参与凝血过程和血液高凝状态、血栓栓塞性疾病等，影响肿瘤进展有关[17].目前发现SCLC发生脉管血栓的研究较少，尤其对于B7-H6阳性的SCLC患者发生脉管血栓的研究，血小板、D二聚体、凝血酶原时间在B7-H6表达阳性的SCLC患者中的临床意义，目前研究更少.本研究首先对接受手术治疗SCLC组织进行B7-H6免疫组化检测，并初步分析B7-H6和D-二聚体、血小板、凝血酶原时间关系，分析B7-H6和脉管内血栓关系.我们发现：在B7-H6阳性组，D-二聚体及血小板计数明显高于B7-H6阴性组；凝血酶原平均时间较B7-H6阴性组缩短，且在B7-H6阳性组，脉管内血栓的病人例数明显高于B7-H6阴性组.上述结果提示在B7-H6阳性组，血液呈高凝状态，且更易发生脉管内血栓，免疫共刺激分子B7-H6可能影响SCLC患者的凝血过程.由于肿瘤微环境存在多种类型共刺激分子，B7-H6作为配体通过自然杀伤细胞表面NKp30 受体相互作用，可促进自然杀伤细胞产生细胞毒性和分泌细胞因子[7,18-19]，产生炎症反应，细胞因子也是影响凝血过程的重要机制之一[20].故B7-H6可能通过影响肿瘤微环境细胞因子分泌，进一步影响SCLC凝血过程，间接参与机体凝血，促进肿瘤进展.

总之，当前研究从免疫共刺激分子和血液高凝状态角度出发，初步发现B7-H6影响SCLC凝血，B7-H6阳性病人易发生高凝状态，更易发生脉管内血栓，因入组研究病人例数有限，B7-H6如何通过影响凝血过程来影响肿瘤进展，其具体机制尚待进一步深入研究，同时也为SCLC的治疗带来新启发.

作者贡献声明

张秀芹：论文的撰写、数据的分析与统计；王志强：临床标本的收集、临床资料的收集和整理；秦燕：免疫组化的实施；张芳：对论文撰写、数据分析、临床资料和病理等整个过程的实施与监督.

利益冲突说明

本研究未到任何第三方企业、公司的资助，文章中的每位作者之间不存在任何利益冲突.