红土沉香的化学成分及其抗炎活性研究

刘园园，王 昊，李 薇，梅文莉，米承能，魏艳梅，戴好富*，姜 北*

(1.大理大学药学院，大理 671003；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室，海口 570100；3.海南省沉香工程技术研究中心，海口571101)

沉香为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)或拟沉香属(Gyrinops)植物受伤后形成的含有树脂的木材，是一种名贵的传统药材和天然香料[1].目前全世界已报道21种沉香属植物及9种拟沉香属植物，主要分布在中国与东南亚部分国家(如老挝、越南、柬埔寨、缅甸、印尼等)[2-3].作为一味传统中药，沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效[4]，同时也被用于治疗与疼痛和炎症相关的疾病如风湿病、关节炎和痛风[5-6]，沉香的现代药理学研究表明其主要化学成分2-(2-苯乙基)色酮和倍半萜类化合物具有抗炎活性[5，7-8]、细胞毒活性[9-10]、乙酰胆碱酯酶抑制活性[11-13]和α-葡萄糖苷酶抑制活性[9，14].倍半萜类化合物是沉香的主要特征成分之一，按照碳骨架类型分为桉烷型倍半萜、艾里莫芬烷型倍半萜、沉香呋喃型倍半萜、沉香螺旋烷型倍半萜、愈创木烷型倍半萜、前深冬烷型倍半萜、杜松烷型倍半萜和菖蒲烷型倍半萜等[2].

越南是沉香的主要出口国之一，其国内90%的沉香基原植物是柯拉斯那(Aquilariacrassna)，柯拉斯那沉香也是国际市场流通沉香的主要组成部分[3].沉香基原植物倒地后被埋入红土中，经过土壤环境和微生物转化，逐渐形成了红土沉香，其表面呈红褐色或土黄色，木心紫褐色，质地硬，油脂分布明显.因为结香条件特殊，红土沉香产量稀少，有“千年沉香，万年红土”之说，其价格可与最珍贵的奇楠相媲美[15].红土沉香珍贵稀有，市场上伪品劣品泛滥，所以研究野生高品质红土沉香的化学成分对其品质鉴定工作具有重要意义.但是目前国内外对红土沉香的研究相对较少，鲜有对其化学成分及生物活性的报道[15].本实验对红土沉香开展系统的化学成分研究，从其乙酸乙酯萃取部位中分离鉴定了13个化合物(图1)，为其质量评价提供了一定的化学依据.另外，化合物3、8和13具有一定的抗炎活性，IC50值分别为81.23 ± 2.83、39.55 ± 3.75和72.63 ± 2.87 μmol·L-1.

图1 化合物1～13的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-13

1 材料与仪器

旋转蒸发仪(上海爱朗仪器公司)；低温冷却循环泵(DLSB-10/30郑州长城科工贸有限公司)；Agilent Infinity 1260分析型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Agilent Infinity1260Ⅱ半制备高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；半制备色谱柱(C18，250 mm × 10.0 mm，5 μm)(日本COSMOSIL公司)；Bruker AmaZon SL质谱仪(德国Bruker)；Bruker AV Ш 500核磁共振波谱仪(德国Bruker)，TMS为内标；超净工作台(上海博讯实业有限公司)；高压蒸汽灭菌锅(日本HIRAYAMA公司)；ELX-800酶标仪(美国宝特公司).柱色谱硅胶(60～80目、200～300目)、薄层层析硅胶板和硅胶H(青岛海洋化工厂)；凝胶Sephadex LH-20(美国Merck公司)；RP-18填料(20～45 μm，日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司)；氘代试剂(青岛腾龙微波科技有限公司)；常用有机试剂为国产AR级试剂(天津市康科德科技有限公司)；脂多糖、Griess试剂、吲哚美辛、四甲基偶氮唑蓝(美国Sigma公司)；DMEM培养基、胎牛血清(赛默飞世尔科技公司)；平衡盐溶液PBS (北京欣经科公司)、碳酸氢钠、DMSO(西陇化工股份有限公司)；小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)购买于中国科学院干细胞库.

沉香样品于2017年11月购于广西凭祥，经本文作者之一中国热带农业科学院热带生物技术研究所戴好富研究员鉴定其基原植物为柯拉斯那沉香(Aquilariacrassna)，标本编号为(YNHT201711)，保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所.

2 提取与分离

将越南红土沉香(干重1 566.6 g)粉碎后，共超声提取6次(每次超声45 min，每次加入95%乙醇5.0 L)，减压浓缩得到乙醇提取物330.6 g.于ddH2O中分散成悬浊液，依次用乙酸乙酯(5.0 L × 3)和正丁醇(5.0 L × 3)萃取，分别得乙酸乙酯萃取物(131.0 g)，正丁醇萃取物(85.8 g).前者采用减压柱色谱，梯度洗脱获31个流分，即Fr.1～Fr.31，(氯仿-甲醇洗脱液梯度为1∶0～0∶1).

Fr.5 (5.1 g)经Sephadex LH-20柱色谱(氯仿-甲醇=1∶1)得到5个流分(Fr.5.1～Fr.5.5).Fr.5.1 (280.0 mg)经硅胶柱色谱氯仿-甲醇(500∶1～50∶1)洗脱得到5个流分(Fr.5.1.1～Fr.5.1.5)，Fr.5.1.1 (104.0 mg)经石油醚-氯仿(2∶1)洗脱得到化合物9(2.0 mg)，Fr.5.1.3(146.5 mg)经石油醚-氯仿(1∶4)洗脱得到化合物10(1.8 mg).

Fr.5.3 (1.6 g)经RP-18柱以甲醇-水(3∶7～1∶0)梯度洗脱，得到17个流分(Fr.5.3.1～Fr.5.3.17).Fr.5.3.5 (24.6 mg)经石油醚-乙酸乙酯(15∶1)洗脱得到化合物13(2.3 mg).Fr.5.3.17 (462.4 mg)经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱(90∶1～10∶1)得到8个流分(Fr.5.3.17.1～Fr.5.3.17.8).Fr.5.3.17.5 (36.8 mg)以硅胶柱色谱分离，氯仿洗脱得到化合物8(4.0 mg)，氯仿-甲醇(100∶1)洗脱得到化合物12(3.0 mg).Fr.5.3.17.6 (11.5 mg)使用半制备高效液相色谱仪(C18柱，甲醇∶水=6.5∶3.5恒梯度洗脱；流速：4 mL·min-1；检测波长：210 nm)，得到化合物2(2.3 mg，tR=35.0 min).Fr.5.3.17.7 (14.6 mg)使用半制备高效液相色谱仪(C18柱，甲醇∶水=7.5∶2.5恒梯度洗脱；流速：4 mL·min-1；检测波长：254 nm)，得到化合物6(1.3 mg，tR=30.0 min).Fr.5.3.17.8 (312.3 mg)经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇(300∶1～50∶1)梯度洗脱得到8个流分(Fr.5.3.17.8.1～Fr.5.3.17.8.8).Fr.5.3.17.8.1 (48.2 mg)经半制备高效液相色谱仪(C18柱，乙腈∶水=5.7∶4.3恒梯度洗脱；流速：4 mL·min-1；检测波长：254 nm)纯化得到化合物3(16.5 mg，tR=26.0 min).

Fr.5.4(2.8 g)经ODS柱以甲醇-水(6∶4～1∶0)梯度洗脱，得到31个亚流分(Fr.5.4.1～Fr.5.4.31).Fr.5.4.12经Sephadex LH-20柱色谱甲醇洗脱得到5个流分(Fr.5.4.12.1～Fr.5.4.12.5)，Fr.5.4.12.5(30.0 mg)经半制备高效液相色谱仪(C18柱，甲醇∶水=6∶4恒梯度洗脱；流速：4 mL·min-1；检测波长：254 nm)纯化得到化合物4(5.9 mg，tR=44.8 min)和5(1.2 mg，tR=46.2 min)和Fr.5.4.12.5.1 (12.0 mg)，Fr.5.4.12.5.1继续经半制备高效液相色谱仪(C18柱，乙腈∶水=5∶5恒梯度洗脱；流速：4 mL·min-1；检测波长：254 nm)纯化得到化合物1(2.0 mg，tR=17.5 min).Fr.5.4.13 (15 mg)经硅胶柱色谱由氯仿-甲醇(800∶1)洗脱得到化合物11(2.5 mg).

Fr.13 (20.1 g)经MCI柱由甲醇-水(6∶4～1∶0)洗脱，合并相似流分得到Fr.13.1～Fr.13.5.Fr.13.2 (3.8 g)经Sephadex LH-20柱色谱甲醇洗脱得到6个流分(Fr.13.2.1～Fr.13.2.6)，Fr.13.2.5 (78.0 mg)经半制备高效液相色谱仪(C18柱，乙腈∶水=3.5∶6.5恒梯度洗脱；流速：4 mL·min-1；检测波长：254 nm)纯化得到化合物7(2.0 mg，tR=14.5 min).

3 结构鉴定

化合物1：无色油状，ESI-MSm/z333.1 [M+Na]+;分子式:C19H18O4;1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ：8.08 (1H，d，J=8.8 Hz，H-5)，7.11 (2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.95 (1H，dd，J=8.8 Hz，2.4 Hz，H-6)，6.83 (2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.82 (1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.07 (1H，s，H-3)，3.91 (3H，s，OCH3-7)，3.78 (3H，s，OCH3-4′)，2.99 (2H，m，H-7′)，2.86 (2H，m，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δ:168.1 (C-2)，110.3 (C-3)，177.9 (C-4)，127.2 (C-5)，114.2 (C-6)，164.1 (C-7)，100.4 (C-8)，158.3 (C-9)，117.7 (C-10)，131.9 (C-1′)，129.4 (C-2′，6′)，114.1 (C-3′，5′)，158.4 (C-4′)，32.3 (C-7′)，36.4 (C-8′)，55.9 (OCH3-7)，55.4 (OCH3-4′).以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定该化合物为7-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮.

化合物2：淡黄色针状结晶(CH3OH)，ESI-MSm/z303.1 [M+Na]+;分子式:C18H16O3;1H-NMR (500 MHz，CD3OD)δ:7.53 (1H，d，J=9.2 Hz，H-8)，7.50 (1H，d，J=3.0 Hz，H-5)，7.38 (1H，dd，J=9.2 Hz，3.0 Hz，H-7)，7.27 (2H，m，H-3′，5′)，7.23 (2H，m，H-2′，6′)，7.18 (1H，t，J=7.1 Hz，H-4′)，6.16 (1H，s，H-3)，3.90 (3H，s，OCH3-6)，3.10 (2H，J=7.2 Hz，H-7′)，3.03 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CD3OD)δ:168.1 (C-2)，109.4 (C-3)，178.5 (C-4)，104.2 (C-5)，156.5 (C-6)，123.7 (C-7)，119.4 (C-8)，151.2 (C-9)，124.3 (C-10)，139.9 (C-1′)，128.9 (C-2′，6′)，128.2 (C-3′，5′)，126.7 (C-4′)，33.2 (C-7′)，36.4 (C-8′)，56.2 (OCH3-6).以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定该化合物为6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮.

化合物3：无色针状结晶(CH3OH)，ESI-MSm/z333.1 [M+Na]+;分子式:C19H18O4;1H-NMR (500 MHz，DMSO-d6)δ:7.29 (1H，s，H-5)，7.24 (5H，m，H-2′～6′)，7.14 (1H，s，H-8)，6.10 (1H，s，H-3)，3.89 (3H，s，OCH3-7)，3.82 (3H，s，OCH3-6)，3.00 (2H，t，J=7.2 Hz，H-7′)，2.93 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8′);13C-NMR (125 MHz，DMSO-d6)δ:170.1 (C-2)，110.6 (C-3)，179.4 (C-4)，104.5 (C-5)，149.3 (C-6)，156.5 (C-7)，100.5 (C-8)，154.6 (C-9)，117.3 (C-10)，141.1 (C-1′)，129.2 (C-2′，6′)，129.1 (C-3′，5′)，127.1 (C-4′)，34.1 (C-7′)，36.7 (C-8′)，57.4 (OCH3-6)，56.6 (OCH3-7).以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定该化合物为6，7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮.

化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z333.5 [M+Na]+;分子式:C19H18O4;1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ:7.54 (1H，d，J=3.1 Hz，H-5)，7.37 (1H，d，J=9.1 Hz，H-8)，7.24 (1H，dd，J=9.1 Hz，3.1Hz，H-7)，7.11 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.82 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.12 (1H，s，H-3)，3.89 (3H，s，OCH3-6)，3.78 (3H，s，OCH3-4′)，3.00 (2H，m，H-7′)，2.90 (2H，m，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δ:168.2 (C-2)，109.4 (C-3)，178.1 (C-4)，105.0 (C-5)，151.2 (C-6)，123.4 (C-7)，119.3 (C-8)，156.5 (C-9)，124.2 (C-10)，131.6 (C-1′)，129.2 (C-2′，6′)，114.3 (C-3′，5′)，158.1 (C-4′)，32.1 (C-7′)，36.4 (C-8′)，55.9 (OCH3-6)，55.2 (OCH3-4′).以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定该化合物为6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮.

化合物5：淡黄色粉末，ESI-MSm/z333.4 [M+Na]+;分子式:C19H18O4;1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ:7.54 (1H，d，J=3.1 Hz，H-5)，7.37 (1H，d，J=9.1 Hz，H-8)，7.24 (1H，dd，J=9.1 Hz，3.1Hz，H-7)，7.21 (1H，t，J=7.9 Hz，H-5′)，6.79 (1H，d，J=7.9 Hz，H-6′)，6.77 (1H，m，H-4′)，6.75 (1H，m，H-2′)，6.14 (1H，s，H-3)，3.89 (3H，s，OCH3-6)，3.77 (3H，s，OCH3-3′)，3.00 (2H，m，H-7′)，2.90 (2H，m，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δ:170.6 (C-2)，109.4 (C-3)，177.9 (C-4)，104.5 (C-5)，151.2 (C-6)，123.2 (C-7)，119.0 (C-8)，156.5 (C-9)，123.9 (C-10)，141.0 (C-1′)，113.9 (C-2′)，159.4 (C-3′)，111.5 (C-4′)，129.7 (C-5′)，120.4 (C-6′)，33.1 (C-7′)，35.7 (C-8′)，55.7 (OCH3-6)，54.9 (OCH3-3′).以上数据与文献[18]基本一致，故鉴定该化合物为6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基苯基)乙基]色酮.

化合物6：淡黄色针状结晶(CHCl3)，ESI-MSm/z349.3 [M+Na]+;分子式:C19H18O5;1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ:7.22 (1H，d，J=9.0 Hz，H-7)，7.10 (2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.86 (1H，d，J=9.0 Hz，H-8)，6.83 (2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.01 (1H，s，H-3)，3.93 (3H，s，OCH3-6)，3.79 (3H，s，OCH3-4′)，2.99 (2H，t，J=7.7 Hz，H-7′)，2.88 (2H，t，J=7.7 Hz，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δ:170.2 (C-2)，107.9 (C-3)，184.0 (C-4)，149.5 (C-5)，143.3 (C-6)，119.1 (C-7)，105.7 (C-8)，150.5 (C-9)，110.8 (C-10)，131.5 (C-1′)，129.2 (C-2′，6′)，158.3 (C-4′)，114.1 (C-3′，5′)，32.0 (C-7′)，36.4 (C-8′)，57.0 (OCH3-6)，55.2 (OCH3-4′).以上数据与文献[17]基本一致，故鉴定该化合物为5-羟基-6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮.

化合物7：红褐色粉末，ESI-MSm/z305.2 [M+Na]+;分子式:C17H14O4;1H-NMR (500 MHz，CD3OD)δ:7.22 (5H，m，H-2′～6′)，6.83 (1H，d，J=2.8 Hz，H-5)，6.73 (1H，d，J=2.8 Hz，H-7)，6.05 (1H，s，H-3)，3.09 (2H，m，H-7′)，2.99 (2H，m，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CD3OD)δ:170.7 (C-2)，109.5 (C-3)，180.7 (C-4)，99.1 (C-5)，156.3 (C-6)，109.7 (C-7)，149.0 (C-8)，141.4 (C-9)，125.8 (C-10)，142.3 (C-1′)，129.2 (C-2′，6′)，127.2 (C-4′)，129.5 (C-3′，5′)，34.1 (C-7′)，37.2 (C-8′).以上数据与文献[19]基本一致，故鉴定该化合物为6，8-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮.

4 抗炎活性

体外抗炎活性试验采用脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7模型[26]：

实验分为阳性对照组(吲哚美辛)、LPS诱导组、空白对照组和实验组.将待测样品分为5个浓度梯度：100、75、50、25、12.5 μmol·L-1.选取对数生长期的RAW264.7细胞，取100 μL细胞液以5 × 104个(每mL)的密度接种于96孔板上，于37 ℃、5% CO2、90%以上湿度条件下培养24 h，再分别加入50 μL配制的LPS(终浓度0.5 μg·mL-1)和50 μL待测化合物溶液(100～12.5 μmol·L-1).继续培养24 h后每孔取100 μL上清液于新的96孔板中，之后向每孔加入100 μL Griess试剂.于酶标仪540 nm波长下测定并记录每孔的吸光值A，采用Griess法[8，27-28]测定化合物对NO释放的抑制率，绘制化合物浓度—抑制率曲线图，计算半数抑制浓度(IC50值).结果见表1.

表1 化合物对LPS诱导巨噬细胞释放NO的半数抑制浓度 (IC50，n=3)Tab.1 IC50 value of compounds on the NO production (n=3)

5 结果与讨论

本实验首次从越南红土沉香中分离鉴定了13个化合物，其中化合物1～7为2-(2-苯乙基)色酮类化合物，化合物8～13为倍半萜类化合物，且化合物1是一个新天然产物.活性试验表明化合物3、8和13具有抗炎活性.

从红土沉香中分离得到的6个倍半萜中，化合物8～11均为艾里莫芬烷型倍半萜，化合物12为沉香呋喃型倍半萜，化合物13为具有清凉木质香味的菖蒲烷型倍半萜.目前从沉香中分离得到的沉香呋喃型倍半萜有15个，且只在白木香(A.sinensis)和马来沉香(A.malaccensis)所产沉香中得到[2].而从沉香中分离得到的菖蒲烷型倍半萜只有3个，均是从白木香(A.sinensis)所产沉香中得到[25，29]，其中有2个是从高品质的奇楠沉香(基原植物为A.sinensis)中得到[25].本研究丰富了红土沉香的化合物类型，也为红土沉香的后续研究以及品质鉴定提供了一定化学依据.