茂名地区婴幼儿G6PD缺乏症基因突变分析

陈红玲 谭满胜 谢清丰 聂俊玮 刘沃满

【关键词】葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶缺乏症;基因突变;荧光PCR 熔解曲线法;流行病学调查

葡萄糖- 6 - 磷酸脱氢酶（ G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t edehydrogenase， G6PD） 缺乏症俗称蚕豆病，指的是红细胞葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶活性降低和（ 或） 酶性质改变导致以溶血为主要表现的一种X 连锁隐性或不完全显性遗传性疾病[1]。我国是G6PD缺乏症的高发区，由南至北发病率逐渐降低，以广东、广西、海南、贵州和台湾等地区发病率较高[2]。G6PD 缺乏症的临床表现差异很大，多数为无症状者，部分患者表现为慢性溶血性贫血症状[3]。较严重者的表现为新生儿期重症核黄疸，可造成死亡或神经系统永久性损伤[4]。G6PD 缺乏症一旦发病可导致严重后果且尚无有效的根治方法，因此，及早地筛查与基因诊断以便采取有效的预防措施和控制诱因，是减少G6PD缺乏症发生最有效的措施[5]。茂名地处广东省西部，是G6PD缺乏症的高发地区，据陈海玲等对茂名地区344763份新生儿血样本进行遗传代谢病筛查结果分析指出G6PD缺乏症发生率高达7.41%[6]。以往本地区对于G6PD 缺乏症的相关研究主要以酶的活性检测为主，涉及基因检测的报道少见。本研究采用荧光PCR熔解曲线法对婴幼儿外周血进行基因检测，探讨茂名地区G6PD基因突变的类型和分布特点，为本地区流行病学调查、临床上诊断和预防G6PD缺乏症提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 对象 从2018 年1 月至2019 年12 月因G6PD 活性检测阳性而召回茂名市妇幼保健院复诊的婴幼儿中抽取326 例进行G6PD 缺乏症基因突变检测，其中男性264 例、女性62例，年龄11 d ～3 岁。基因的检测均对婴幼儿的法定监护人进行知情告知并签署同意书。

1.2仪器和试剂 ①仪器：实验中用到的仪器设备有：厦门致善Lab-Aid 820核酸提取仪、赛默飞世尔BIOMATE 3S紫外分光光度计和美国伯乐CFX-96荧光定量PCR仪。②试剂：Lab-Aid 820核酸提取Mini试剂和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测试剂均来源于厦门致善生物科技股份有限公司。

1.3 方法 ①样本采集：抽取上述患儿静脉血1 mL 于EDTA 抗凝管中送检，暂未检测标本置于4℃～8℃保存不超过一周。②试剂的准备：在试剂准备区将PCR 反应液A 和B按要求配制并分装于PCR 薄壁反应管。将配制好的PCR 反应管转移至标本制备区，贮存于-18℃以下直至样本DNA提取完。③ DNA 的提取及加样 用Lab-Aid 820 核酸提取仪提取样本的DNA，用BIOMATE 3S 紫外分光光度计测定提取的DNA 样本的浓度和纯度，DNA 样本的OD260nm/OD280nm 均在1.6-2.0 范围之间，且OD260nm/OD230nm ≥ 2.0。按试剂盒说明书加样，盖上管盖，瞬时离心后转移至PCR 扩增区。④ PCR扩增、溶解曲线的分析和结果的判读 在具有FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道多色熔解曲线分析功能的BIO-RAD CFX96PCR 扩增仪上设置PCR 反应程序为：50℃ 2 min → 95℃ 10min → （95℃ 15 s → 65℃-56℃（ 每个循环下降1℃）15 s → 76℃20 s）×10 个循环→ （95℃ 15 s→ 55℃ 15 s→ 76℃ 20 s）×50 个循环→ 95℃1 min → 35℃ 3 min → 40℃-85℃以0.4℃/5 s 的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道荧光信号。结果的判读通过比较待测样本在A 和B 体系中共八个检测通道的熔解峰与野生型对照对应通道的熔解峰之间熔点（Tm 值） 的差异判断样本是否发生突变，当样本熔解峰与野生型对照对应熔解峰差异（ΔTm 值）在±1℃以内的即为野生型峰，差异超过±2℃的即为突变型峰[7]。本次检测中国人群常见的12 种G6PD 基因突变的类型及各突变型在对应通道的ΔTm值波动范围见表1。

2 结果

对茂名地区G6PD 活性筛查阳性召回的326 例婴幼儿（ 男性264 例，女性62 例），采用荧光PCR 熔解曲线法进行基因突变检测，共检出基因突变301 例（ 男性249 例，女性52 例），基因突變率92.33%。在301 例突变样本中检出10 种单一突变和5 种复合突变，占比由高到低以c.1388 G>A、c.1376 G>T、c.95 A>G、c.871 G>A 和c.392 G>T 这5 种突变为主，共占91.03%，未检出c.383 T>C、c.592 C>T 两种突变类型，突变类型和分布情况见表2。

3 讨论

葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶（G6PD） 缺乏症是最常见的一种遗传性酶缺乏病，由位于X 染色上的G6PD 基因突变导致G6PD酶活性降低或缺乏，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，从而引起溶血性贫血[8]。G6PD 基因定位于X 染色体长臂2 区8 带（Xq28）[9]。男性携带者称为半合子;女性两条X 染色体都带有致病基因时称为纯合子，仅一条X 染色体带有致病基因时称为杂合子。女性杂合子因酶的活性缺乏程度不同而临床表现差异较大，女性纯合子和男性半合子则表现为酶的活性显著缺乏，临床症状较重。

本研究采用的荧光PCR 溶解曲线法根据靶与探针杂交产物熔点的差异能够一次性检测12 种中国人群常见G6PD 基因突变类型，结果显示茂名地区婴幼儿的G6PD 基因突变类型以c.1388G>A、c.1376G>T 和c.95A>G 为主，占比分别为36.21%、30.90%、10.96%，这与国内报道的中国人群的主要突变类型是相符的，但所占比例存在一定差异;另外，检出的其他突变类型也与其他地区存在差异性。这表明茂名地区G6PD 基因突变类型既具有中国人群普遍的特征，也具有本地区的特征性。

本研究326 例G6PD 缺乏症患者中，有301 例样本检测出基因突变，包含10 种单一突变类型和5 种复合突变类型，在检测范围内未发现c.383T>C 和c.592C>T 两种突变，这可能与检测的标本量存在一定的关系。另外有25 例样本未检测到基因突变，一方面原因可能是部分筛查的样本是由外院采集后送至本院检测，标本运送时间长、保存不当或处理等因素均可能造成G6PD 酶活性降低;另一方面原因可能是G6PD酶活性受某些疾病或者药物的影响而降低;最后也可能是存在试剂盒检测范围以外的基因突变类型，这有待后续通过其他检测试剂盒或使用基因测序等方法进一步研究。因为受标本质量、疾病和药物等因素影响，再加上部分女性杂合子G6PD 缺乏症状不明显，所以临床上单纯依靠新生儿纸片法初筛和酶法检测的结果来诊断G6PD 缺乏症也还存在一定的缺陷。因此，进行G6PD 基因突变检测还是很有必要的，能够在基因层面为临床提供更为准确的诊断依据。本研究采用的荧光PCR 溶解曲线法具有操作简便、重复性好、准确度高、检测覆盖范围广等特点，该技术在本地区的应用，可为本地区进行大规模的G6PD 缺乏症的分子流行病学调查提供技术保障。

综上所述，本研究对茂名地区婴幼儿G6PD 基因突变的类型进行分析，为本地区流行病学调查、临床上诊断和预防G6PD 缺乏症提供了有价值的参考依据。在婴幼儿群体中应积极开展G6PD 缺乏症的基因突变检测，根据检测结果指导临床用药和患儿家属喂养，从而预防溶血性疾病的发生，有利于提高本地区的人口素质与健康。