肾苏Ⅳ对糖尿病肾病大鼠足细胞、podocin及VEGF水平的影响

黄勇 程洁 周晔华 王茂泓 黄雅倩 吴国庆 皮持衡

(江西中医药大学 1附属医院肾病科，江西 南昌 330019；2科技学院)

糖尿病(DM)肾病(DN)又称DM肾小球硬化症，是DM的主要并发症之一〔1〕。DN的发病率比一般疾病高，且疗效差，其特点主要以肾小球血管受损、硬化为主，临床上表现为尿蛋白排泄量增加〔2〕。目前来看，足细胞是通过肾小球基底膜外侧的细胞高度分化而来，并且足细胞结构的改变和分子的异常表达都和DN蛋白尿的产生有密不可分的联系，其中导致DN持续发生的主要因素就是足细胞的损伤情况〔3〕。

裂孔隔膜上的蛋白分子是维持足细胞结构的稳定和功能的关键，例如podocin蛋白分子等，在肾小球的滤过屏障中，这些蛋白分子决定着其选择性的功能〔4〕。血管内皮生长因子(VEGF)是一种多向性分子，其中在骨髓的造血细胞、发育肾组织的神经纤维中，都有VEGF的表达，并且多种的生物效应也会通过VEGF和VEGF异性受体相互结合而发挥出来〔5〕。肾小球中的VEGF可自行分泌后再作用于足细胞，并增殖并分化足细胞，对足细胞有非常重要的作用〔6〕。研究证实，肾系膜细胞中的VEGF mRNA的表达可以通过高糖进行刺激，以此来增加其表达〔7〕，由此可见，VEGF在DN的发生和发展中起着非常重要的作用〔7〕。本研究在以往关于“肾络病症”的基础上，采用“益气祛风、养血和络”的创新性思路干预DN足细胞损伤，通过建立DN大鼠模型，观察中药复方“肾苏Ⅳ”对大鼠的足细胞超微结构和其相关的分子podocin和VEGF的表达的影响。

1 材料和方法

1.1材料 动物：选用雄性SD大鼠，均由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，共30只。所有大鼠体重160～180 g，常温下饲养大鼠，让大鼠自由饮水摄食7 d，让所有大鼠对新的环境进行适应。

试剂与仪器：本实验所用试剂和仪器分别为：江西中医药大学附属医院中药房按照比例煎制肾苏Ⅳ，按照黄芪30 g，炒当归10 g，青风藤15 g，泽兰15 g，汉防己10 g，僵蚕10 g，重楼10 g的比例进行调制。所有药品重复煎煮3次，把煎煮完的药物浓缩为100 ml的汁液备用。Sigma公司生产的链脲佐菌素(STZ)；Abcam公司生产的山羊兔抗podocin抗体；北京中山生物技术有限公司生产的兔抗VEGF抗体；强生中国有限公司生产的强生稳步型血糖测试仪；苏净安泰公司生产的超净工作台；日本日立公司生产的透射电镜；美国RD公司生产的大鼠尿白蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒。

1.2动物分组与模型建立 所有大鼠适应1 w新的环境，禁食12 h，把大鼠平均分为正常对照组(NC组)，DN大鼠模型组(DN组)和DN大鼠模型加肾苏Ⅳ治疗组(SC组)。除NC组外的大鼠均建立DN大鼠模型，DN组和SC组大鼠腹部注射STZ溶液，60 mg/kg其中STZ溶液是由pH值为4.5的柠檬酸盐缓冲液配制而成，其中柠檬酸盐含量为0.1 mol/L。NC组大鼠注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。饲养大鼠1 w后采取大鼠的尾静脉血液，测量空腹大鼠的血糖，当测量的值≥16.7 mmol/L为成功建模。在造模成功后第1天起，SC组大鼠给予剂量为1.8 ml/400(g·d)的肾苏Ⅳ灌胃，NC组和DN组大鼠灌服同等剂量生理盐水，干预周期6 w。

1.3收集标本 结束实验之前的1 d，开始用代谢笼收集大鼠24 h的尿量，并对其尿量进行记录。称重后分离腹主动脉血清，并把血清置入-20℃中保存待用。采取大鼠10 ml的心脏血液，置于-70℃的环境中保存。处死大鼠后，将大鼠的左肾取出并称其重量，采取肾皮质区中的多块肾组织，大小为1 mm3，把肾组织块用戊二醛进行固定，以备电镜检查使用。取出双侧肾脏并称重，称重前把表面的血液吸干，其中一部分的肾组织用甲醛进行固定，待石蜡切片使用。将剩余的肾组织冷藏在液氮中，最后放置在-80℃冰箱中保存。

1.4观察一般状态 一般状态包括精神、活动、毛发的色泽及脱落、体重和排便等。

1.5肾指数和血糖的测定 3组各处死3只大鼠，取出大鼠两侧的肾并称重，称重前将表面的血液吸干，计算肾指数。采用酶耦联比色法检测3组大鼠尾静脉血的血糖。

1.6生化检测 采用全自动的生化分析仪检测3组大鼠的生化情况，其中包括血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和肌酐(Scr)的浓度。用双缩脲法测定24 h的尿蛋白(Pro)。

1.7透射电镜检查大鼠超微结构 将固定好的肾组织块取出，进行磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗、脱水并切成80～90 nm的片状，透射镜观察被温染的组织，具体观察足细胞个数，足突平均宽度(FPW)、足突融合率和基底膜厚度(GBM)。

1.8肾脏组织形态学观察 每组大鼠各处死3只，具体的操作如下：取出肾皮质，用甲醛将肾皮质固定1 d，切片，厚度为3 μm，将组织进行苏木素-伊红(HE)染色和PAS染色后进行观察。

1.9Western印迹检测大鼠肾组织中podocin和VEGF蛋白的表达 将3组肾组织分别提取100 mg，将细胞裂解并提取核蛋白测量浓度，分装后，保存在-20℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液混匀，按照4∶1进行，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液煮沸处置。电泳板孔内注入蛋白样品50 μg。转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后加脱脂奶粉，封闭1 h。TTBS洗涤要在加入的1抗前进行，每次漂洗10 min，一共进行3次漂洗，最后加入2抗对溶液进行稀释，再在常温环境中封闭1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，二氨基联苯胺(DAB)显色后数码相机照相。

1.10统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠一般状态比较 NC组大鼠毛发很有光泽，自由活动且有灵敏的反应。DN组大鼠精神状况欠佳，且大鼠均反应缓慢，活动也很疲倦，毛发泛黄无光泽，还有大鼠出现脱毛的情况，大鼠伴随尿量也增多，体重也明显减轻；与DN组大鼠相比，SC组大鼠的情况明显出现好转。

2.2各组大鼠体重、肾指数和血糖的比较 与NC组比较，DN组和SC组体重明显降低、肾指数、血糖水平均明显升高(均P<0.05)；SC组体重明显高于DN组，且肾指数和血糖水平均明显低于DN组(均P<0.05)。见表1。

2.33组生化检测比较 与NC组比较，DN组和SC组Pro、TC、TG和Scr水平均明显增高(P<0.05)；与DN组比较，SC组各项指标水平均明显下降(均P<0.05)，见表1。

2.43组肾脏组织形态比较 NC组的肾组织形态均正常，与NC组相比，DN组肾小球肥大，毛细血管基底膜增厚，系膜基质中有增生出现，肾小管上皮细胞也出现了空泡样变，蛋白管型较为常见。与DN组相比，SC组肾组织形态明显变好，如图1。

黑色箭头表示肾小球，绿色、红色箭头表示肾小管图1 3组肾组织形态(×50)

2.53组足细胞个数和FPW等比较 NC组足细胞结构完整，足突的排列整齐有序，清晰可见；与NC组相比，DN组足突有增宽的现象，有的足突已经融合并且消失，足细胞也不完整且减少，大鼠的基底膜有也明显增厚的情况出现。与NC组比较，DN组和SC组FPW、融合率及GBM均明显增高，而足细胞个数明显下降(均P<0.05)；与DN组比较，SC组FPW、融合率和GBM均明显下降，而足细胞个数明显上升(均P<0.05)。见表2、图2。

2.6Western印迹检测podocin和VEGF的蛋白水平 DN组肾组织中podocin蛋白的表达明显低于NC组，而VEGF蛋白的表达明显高于NC组(P<0.05)；与DN组相比较，SC组大鼠肾组织中podocin蛋白明显升高，且VEGF蛋白的表达显著下降(P<0.05)，见表2、图3。

黑色箭头表示足突，红色箭头表示基底膜图2 3组电镜下滤过膜的超微结构(×20 000)

图3 3组podocin和VEGF蛋白表达

3 讨 论

在DM中最常见的微血管并发症为DN，遗传易感性和高糖长时间的相互作用，从而让DN不断发生与发展。DN不仅会因为肾小球基底膜增厚而发生基本的病理改变，还会受到基质样物质增生的影响，在临床上通常表现为尿蛋白的排泄持续性的增加〔8〕。足细胞结构及功能的改变是蛋白尿产生的病理基础，并成为DN持续进展的关键因素〔9，10〕。相邻足突之间的裂孔是由podocin、VEGF等多种蛋白分子相互连接，从而阻止大分子物质通过，让肾小球滤过膜有高度的选择性。podocin、VEGF均为跨膜蛋白并特异性表达在裂孔膜上，podocin通过其C末端与CD2相关蛋白的胞内段相互作用，可促进信号传导。研究表明，podocin和VEGF信号传导异常可引起足细胞功能异常并导致蛋白尿的发生〔11〕。从中医角度分析，DN病程绵长，肾气虚弱是导致疾病慢化性的主要因素，其疾病虚实错杂的病例原因是湿浊、瘀血、热毒和外邪等。前期围绕“肾脏固有细胞功能调节”进行了系列研究〔12，13〕，本研究在之前的基础上筛选具有疗效优势的中药复方肾苏Ⅳ对DN大鼠进行干预，并且探讨DN大鼠抑制足细胞损伤的机制。

本研究结果说明DN发生时，在糖代谢异常的基础上，出现脂质代谢紊乱和肾功能损害，在肾苏Ⅳ干预后，SC组大鼠的情况都明显好转。肾苏Ⅳ由3组药物组成：①以生黄芪、炒当归益气养血，充养肾络；②以汉防己、青风藤、僵蚕祛风胜湿，搜剔肾络风湿伏邪；③以重楼、泽兰解毒通络。诸药协同以益气祛风、养血和络，促进肾络气血调和〔14〕。

DN发生时，高糖可下调podocin的表达也是导致其发生的主要原因。①DN会让组成裂孔膜的分组发生改变，减少足突之间的分子链接，甚至中断分子链接，进而改变足突的形态〔15，16〕；足突会在高糖的状态下完全的融合，甚至完全消失不见，podocin蛋白的表达也会受高糖的影响而减少，从此让蛋白尿的排泄增多〔17，18〕。②在肾组织中podocin的表达降低，阻碍了细胞外到内CD2相关蛋白和细胞骨架蛋白之间的信号传递，足细胞的结构因此而受到破坏；当足细胞脱落后，基底膜裸露，毛细血管袢由于静水压的作用向包曼氏囊腔侧凸出、粘连，甚至肾小球局灶节段硬化形成〔19，20〕。本研究结果提示肾苏Ⅳ可通过改善足细胞的结构而减少尿蛋白形成，减轻高血糖所致的肾脏损害。研究发现，复方肾苏Ⅱ能够有效地延缓慢性肾脏病早期患者肾纤维化进程，肾功能有显现改善〔21〕。研究发现辛通畅络法复方肾苏Ⅱ可通过作用于转化生长因子(TGF)-β1，从而延缓FSGS大鼠肾间质纤维化进程〔22〕。尚懿纯等对局灶节段性肾小球硬化大鼠做研究发现，肾苏Ⅱ方可延缓FSGS大鼠疾病进展的作用机制为抑制了Notch1、P53活性，从而阻抑足细胞凋亡进程〔23〕。本研究发现肾苏Ⅳ能使肾组织中podocin蛋白表达上调，并且随着足突和基底膜改善更明显，大鼠Pro也显著减少，可见肾苏Ⅳ可增加podocin表达，对肾小球过滤有一定的恢复作用，减轻蛋白尿的形成；但肾苏Ⅳ对足细胞podocin分子结构上是否存在血管紧张素Ⅱ受体有待进一步研究。

DN的发生中细胞因子的作用备受人们的关注，VEGF属于一种有丝分裂原，在血管的内皮细胞中有一定的作用，促进其细胞的增殖，同时还增加血管的通透性，一定程度上改变了内皮细胞的结构和功能，细胞外基质被合成，在DN中的作用非常的重要。研究证实，DN患者比正常人的VEGF蛋白表达明显增多，并且经过肾苏Ⅳ干预后发现其蛋白表达会明显下降〔24〕。

综上，肾苏Ⅳ可有效地调控podocin和VEGF蛋白表达的平衡，从而改善足细胞超微结构的病变，同时对DN有一定的防治作用。