中性粒细胞对非小细胞肺癌自噬和凋亡的影响及机制

王保明 马冬春 闵旭红 陈晓宇 朱学应

(安徽省胸科医院 1胸外科，安徽 合肥 230022；2肿瘤放疗科；3安徽医科大学基础医学院)

中性粒细胞(PMN)是一类重要的免疫细胞。在急性炎症反应中，PMN过趋化运动的方式被募集到感染或组织损伤部位，进而通过吞噬、脱颗粒作用杀死病原体〔1〕。此外，PMN也被发现存在于多种癌症的肿瘤微环境中，被称为肿瘤相关PMN(TANs)〔2〕，已有研究表明，TANs的在肿瘤发生中功能非常复杂，并受到多种细胞因子、信号通路的调控，在肿瘤的发展进程中，不同亚群的TANs发挥的生理功能也不尽相同，有的TANs可以通过释放蛋白酶和细胞因子促进肿瘤的侵袭和肿瘤血管新生〔3,4〕，也有的TANs也发挥了抑制肿瘤生长的作用〔5,6〕。非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺部恶性肿瘤之一〔7〕。在NSCLC组织中，也发现了PMN的浸润〔8〕。然而，PMN浸润在PMN疾病进展中的功能及其作用机制还缺少深入的研究。PMN间接接触共培养法，即使用培养过PMN的培养基继续培养肿瘤细胞，能够避免细胞直接接触造成的干扰，是研究PMN分泌蛋白对肿瘤细胞作用的常用方法〔9,10〕。本研究采用体外分离小鼠骨髓PMN条件培养基与PMN细胞系A549共培养，探究了PMN对A549细胞凋亡和自噬的调控作用。

1 材料和方法

1.1试剂和材料 主要试剂：RPMI1640培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 3000、膜联蛋白(Annexin)V凋亡检测试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific公司；人淋巴细胞分离液(Histopaque 1077/1119)购自美国Sigma公司；抗(Anti)-微管相关蛋白1轻链(LC)3抗体、Anti-p62抗体、Anti-蛋白激酶B(AKT)抗体、Anti-磷酸化(p)-AKT抗体购自美国Cell Signaling Tech公司；Anti-p-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗体购自美国Abcam公司。主要材料：NSCLC细胞系购自中国科学院上海细胞库；野生型C57BL/6小鼠购自维通利华公司。

1.2分离小鼠骨髓PMN并获取PMN条件培养基 引颈处死8周龄健康小鼠，取小鼠股骨和胫骨，剥离肌肉组织后放置在PBS中。剪去股骨和胫骨两端，用PBS冲洗骨髓细胞，得到骨髓细胞悬液。使用密度梯度离心的方法，将骨髓细胞悬液放置在Histopaque-1077/1119密度梯度分离液上，室温1 200 r/min离心30 min，分离得到的PMN用PBS洗1次，培养在RPMI1640培养基中，培养24 h后，收集培养基，1 200 r/min 离心10 min，取上清即为PMN条件培养基。

1.3细胞增殖实验 将A549细胞消化并重悬得到细胞密度为1×105个/ml的细胞悬液，取100 μl接种于96孔培养版中，实验组使用PMN条件培养基，对照组使用正常培养基(90% RMPI1640+10% FBS)。在指定时间点每空加入10 μl CCK-8溶液，放置于 37℃二氧化碳培养箱中孵育4 h，随后用酶标仪测度450 nm吸光值。

1.4细胞凋亡实验 胰酶消化收集单细胞悬液，并用PBS清洗1次。加入 Annexin V 结合缓冲液重悬细胞，取100 μl细胞悬液加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl PI 染色液混匀，室温避光放置15 min。随后加入400 μl Annexin V结合缓冲液，上流式细胞仪检测。

1.5蛋白质免疫印迹实验 胰酶消化收集单细胞悬液，离心去除上清培养基后，加入200 μl细胞裂解液，放置于冰上裂解20 min。加入5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，100℃水浴加热10 min，得到变性的蛋白质样品。蛋白样品经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上经脱脂奶粉封闭后，加入一抗稀释液室温孵育1 h，随后加入辣根过氧化物酶耦联的二抗稀释液室温孵育45 min，最后加入显色底物，使用凝胶成像仪拍摄发光信号。

1.6免疫荧光实验 贴壁培养的A549细胞用4%多聚甲醛室温固定10 min，用PBS清洗1次，加入0.1 % Triton X-100孵育10 min，再次用PBS清洗1次，加入2% 牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min。随后用鼠源抗LC3抗体室温孵育45 min，再用FITC耦联的羊抗鼠IgG荧光二抗孵育30 min，用PBS清洗3次后，加入DAPI对核酸进行染色标记。最后使用正置荧光显微镜拍照。

1.7统计学分析 采用Graphpad Prism7.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1PMN条件培养基抑制A549细胞增殖 实验组72 h时，A549细胞的增殖活性与对照组相比明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组A549细胞增殖活性

2.2PMN条件培养基促进A549细胞凋亡 与对照组〔(6.21±1.20)%〕相比，实验组〔(10.84±2.47)%〕细胞凋亡水平显著上升(t=2.92，P=0.043 2)。

2.3PMN条件培养基促进A549细胞自噬活性 对照组中，LC3主要呈弥散状分布在细胞质中，较少呈现点状定位，表明细胞自噬活性较弱，而实验组细胞中，LC3大多出现点状聚集定位，表明细胞自噬活性较高。见图1。

图1 免疫荧光染色法检测LC3蛋白(×1 000)

2.4PMN条件培养基抑制A549细胞AKT-mTOR信号通路 见图2、表2。与对照组相比，实验组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达水平明显上升，p-AKT的表达水平也明显提升，p-mTOR的表达水平明显下降(P<0.05)，总AKT蛋白的表达水平没有明显变化。

图2 蛋白质免疫印迹实验检测AKT-mTOR信号通路

表2 各组蛋白相对表达水平

3 讨 论

PMN在NSCLC肿瘤组织中的浸润很早就被发现，但其对NSCLC疾病进展的作用还不是很清楚〔8〕。韩露露等〔11〕发现二甲基亚砜(DMSO)诱导HL-60细胞分化成的PMN样细胞条件培养基会抑制NSCLC血管新生能力，但其对细胞活性的影响还没有深入研究。本研究结果说明PMN条件培养基可以抑制NSCLC细胞的增殖，促进细胞凋亡。LC3是常用的检测细胞自噬活性的标记蛋白。在正常生理条件下，LC3定位在细胞质中，称为胞质型LC3(LC3-Ⅰ),在细胞自噬被激活后，LC3-Ⅰ能够结合磷脂酰乙醇胺(PE)，转变成为LC3-Ⅱ，定位在自噬小体的膜上〔12〕。因此，A549细胞中LC3呈现点状定位及LC3-Ⅱ水平升高均能表明PMN条件培养基促进了细胞的自噬活性。

正常细胞通常会通过一定水平的自噬活性来清除蛋白和受损细胞器，维持细胞内稳态。肿瘤细胞中常常出现自噬被抑制，激活肿瘤细胞的自噬活性可以促进细胞凋亡〔13〕。在KRASG120D突变引起的NSCLC模型小鼠中，如果同时缺失自噬关键蛋白p62，肿瘤的生长会被抑制〔14,15〕。然而，也有报道发现激活自噬也可以促进肿瘤的发生〔13,16〕，这表明细胞自噬可能通过不同的机制调控肿瘤的发生发展。肿瘤细胞的自噬除了被细胞内的信号转导通路调控，同样也受到缺氧、营养不足及细胞外基质等肿瘤微环境的影响。研究表明，免疫反应产生的许多细胞因子如干扰素(IFN)-γ〔17〕、肿瘤坏死因子(TNF)-α〔18〕等促进细胞的自噬活性，这些细胞因子对NSCLC细胞自噬活性的调控是通过活化核转录因子(NF)-κB信号通路实现的。此外，本研究还发现PMN条件培养基可以抑制A549细胞的AKT-mTOR信号通路。AKT-mTOR是调控细胞自噬反应的重要信号通路，AKT的活性抑制会引起mTOR活性的下降，而mTOR可以直接调控自噬相关蛋白ATG13的磷酸化水平调控细胞自噬活性〔19〕。

肿瘤部位浸润的PMN也可以分泌多种细胞因子、活性氧和颗粒酶等，参与调控肿瘤的生长〔20〕，然而具体是哪些细胞因子或蛋白促进了NSCLC细胞的自噬和凋亡还需要进一步的研究。