HPLC-CMC筛选6种中药材治疗慢性牙周炎的活性成分

刘 丽，俞海龙,李雅萍，王 静，刘文婕,王欣欣， 李 成，张艺村

慢性牙周炎通过药物等其他刺激因素干预体外分离培养的牙周膜细胞,来达到牙周组织再生、重建已成为牙周炎治疗的研究热点[1]。目前临床用于控制牙周炎的药物主要为抗生素类的化学制剂，中药制剂应用较少[2]。传统的药物提取、分离纯化繁琐低效，而细胞膜色谱法(CMC)作为一种新兴的生物亲和色谱法，不需要预先对样品进行分离和纯化，能够在特定的活性细胞膜筛选模型上直接确定与膜受体发生结合的中药某种活性部位，从而达到快速、高效、准确的筛选[3]。本实验以辛伐他汀为阳性对照药对该方法进行筛选测试分析，并考察其适用性，从而筛选6种中药与牙周膜细胞能结合的活性成分，为后期治疗慢性牙周炎局部凝胶制剂的开发提供了理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：CO2培养箱(BB16)(德国Heraeus)，倒置相差显微镜(日本Nikon)，细胞计数板(上海安信光学仪器制造有限公司)，JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，细胞膜色谱柱芯组件(10 mm柱长，2 mm内径，0.22 μm筛板孔径)(深圳逗点生物技术有限公司)，RPL-ZD10型装柱机(大连日普利科技仪器有限公司)，VICI AG10G-0911V10 通切换阀(美国Valco仪器公司)，Concentrator真空旋转蒸发仪(德国eppendorf公司)，Shim-pack VP-ODS液相色谱柱预柱(10 mm柱长，1 mm内径，5 μm粒径，C18键合硅胶固定相)(日本Shimzdzu公司)，LC-MS-2010EV高效液相色谱-质谱联用仪系统(包括2部 LC-20 液相色谱泵，1部DGU-20A3在线脱气机，1部SIL-20A自动进样器，1部CTO-20A色谱柱温箱，1根Shim-pack VP-ODS高效液相色谱柱，1部 SPD-20A UV检测器，1部SPD-M20A DAD检测器，1部LC-MS-2010EV质谱仪及LC-MS Solution色谱工作站)(日本Shimzdzu公司)。本研究细胞培养部分在西安交通大学附属口腔医院口腔医学研究中心完成，细胞膜色谱部分在西安交通大学国家药学重点研究中心完成。

1.2 试药：苦豆子、甘草、三七、丹参、续断、杜仲均购自国大药房(均经鉴定为原药)；试药辛伐他汀(SIM)对照品(中国北京药品生物制品检验所，纯度≥98%)；胎牛血清、培养基DMEM、胰蛋白酶(GIBCO，美国)；乙腈，甲醇为色谱纯(Fisher，美国)；ZEX-Ⅱ大孔硅胶(青岛美高贸易有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 药物制备：苦豆子、甘草、三七、丹参、续断、杜仲粉末各10 g，用40 mL的甲醇-水(70∶30，v/v)溶液超声提取30 min×3次，取上清液真空干燥；色谱甲醇复溶得到苦豆子、甘草、三七、丹参、续断、杜仲的甲醇总提取物，2 mL去离子水使其完全溶解；再依次加入极性不同的有机溶剂(石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯)各10mL，超声萃取30min×3次，分别收集6种部位的提取液，干燥后甲醇复溶、过滤。

1.3.2 hPDLC/CMC色谱柱制备：将门诊正畸拔除牙周膜消化培养原代的人牙周膜细胞(hPDLC)传至4～8代，用10 mL Tris-HCl低渗液制备成细胞膜悬液5 mL，动态加入装有活化硅胶载体的支口试管；次日将混合液洗涤收集沉淀加入10 mL去离子水，涡旋震荡混匀，即得hPDLC/CMC固定相悬液，湿法装入细胞膜色谱柱芯柱套中即得hPDLC/CMC色谱柱，连接至色谱系统中使用。

1.3.3 阳性药物SIM对hPDLC/CMC的测试分析及适用性考察：将一根hPDLSC/CMC色谱柱充分平衡后，连续进样 5 μl 0.2 mg/mL 的 SIM 3次，以保留时间为指标来考察色谱柱的内差异性；此外按照相同方法制备 3根hPDLSC/CMC 色谱柱，同时将 3根色谱柱置于液相色谱内，在相同条件下分别进样 5 μl 0.2 mg/mL SIM，以每根色谱柱上的保留时间峰面积为指标，考察柱间差异性。利用3次富集组分的峰面积得出富集后的平均峰面积来计算相对标准偏差(RSD值)，要求符合定性实验RSD<5%。

1.3.4 苦豆子、甘草、三七、丹参、续断、杜仲提取物中活性成分的筛选：为了验证hPDLSC/CMC膜表面受体特异性结合的药物某特定成分具有分离保留活性，实验比较了在相同长度的纯硅胶色谱柱和hPDLSC/CMC色谱柱上SIM及各药物活性部位色谱峰的保留位置、峰形及活性持续时间，将能够在hPDLC/CMC上产生良好保留峰形的提取物称为其活性部位。操作如下：将hPDLC/CMC色谱柱连接入液相色谱系统中，按照选定的色谱条件：流动相(去离子水、5 mmol/L磷酸盐缓冲液)，柱温37.0 ℃，流速0.2 mL/min，用流动相平衡23 h待基线平稳后，吸取苦豆子、甘草、三七、丹参、续断、杜仲各部位的提取液5 μl注入色谱系统进行分析测定:SIM定容至0.2 mg/mL，(检测波长：238 nm)；苦豆子(检测波长：205 nm)、甘草(检测波长：210 nm)、三七(检测波长：203 nm)、丹参(检测波长：280 nm)、续断(检测波长：212 nm)、杜仲(检测波长：230 nm)各提取物定容至1 mg/mL，并采用UV检测器记录CMC色谱图。

2 结果

辛伐他汀在hPDLSC/CMC 色谱柱的10 min 左右，有明显的保留色谱峰出现(图1，目录后)，而在纯硅胶色谱柱上并无任何保留(图2，目录后)，色谱柱内及柱间RSD值均<5%，见表1。

表1 hPDLC/CMC柱的柱内柱间保留时间(min)

通过对辛伐他汀系统适用性考察内容的分析，说明hPDLC/CMC色谱柱具有很好的分离活性，其柱内及柱间重现性良好，而且活性保留时间也能够满足定性鉴别试验的要求，可以用于从中药复杂体系中筛选活性化合物。苦豆子(图3，目录后)，甘草(图4，目录后)，杜仲(图5，目录后)检测无保留色谱峰；三七(图6，目录后)，丹参(图7，目录后)，续断(图8，目录后)的主要成分分别进样检测均产生良好保留峰形。

3 讨论

通过对辛伐他汀适用性考察实验结果，说明hPDLC/CMC色谱柱具有很好的分离及保留活性，SIM在hPDLSC/CMC 有保留是因为硅胶表面包覆的hPDLSC 膜受体和SIM之间的特异性结合作用所导致，而纯硅胶柱上则没有这种特异性结合。色谱柱由于其受体活性存在而对药物具有一定的分离活性。本研究结果说明实验差异性较小，重现性良好，能够满足定性鉴别试验的要求，可以用于从中药复杂体系中筛选活性化合物。本研究通过HPLC-CMC实验方法，从苦豆子、甘草、三七、丹参、续断、杜仲6种中药材中有效筛选出了三七、丹参、续断3种药物某活性成分，可以与人牙周细胞膜受体有特异性结合。

苦豆子有清热解毒、燥湿、止痛的作用，苦豆子生物碱对炎症早期的渗出和水肿有明显抗炎作用[4]。甘草有很高的临床应用价值，如增强免疫、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗纤维化等诸多作用[5]。甘草次酸可能阻止前列腺素等物质的产生和释放，降低活性因子反应性，而发挥抗炎、抗菌作用[6]。川续断作为一种补药、止痛剂和抗炎药，常被用于腰痛、膝痛、风湿性关节炎、颅内血肿、先兆性流产和骨折等疾病的治疗[7]。有研究表明，川续断皂苷Ⅵ可以显著增加MC3T3-E1和小鼠原代培养成骨细胞的细胞增殖、分化，明显增加了成骨细胞碱性磷酸酶活性，促进成骨细胞的成熟[8]。杜仲具有补肝强肾、强筋健骨，能抑制多种细菌和病毒；另外，杜仲具有双重调节人体骨代谢平衡，从而促进骨形成[9]。三七具有止血、散疲、消肿止痛功效，具有保护心肌细胞、降血脂、抗血栓、增强免疫力、抗炎、抗纤维化、消除氧自由基等作用；三七总皂昔对多种实验性模型有良好的抗炎作用，它能对抗前列环素的释放，抑制巨噬细胞受到炎症刺激和白介素的释放[10]。丹参具有活血祛瘀、通经止痛、凉血消痈功效。有研究表明，丹参的脂溶性成分具有抑菌作用，丹参水溶性部位萃取物具有显著抗炎作用[11]。丹参或可通过miRNA-155降低脓毒症大鼠血清IL-6、IL-10水平,从而减轻脓毒症的炎症反应[11]。

药物靶标的筛选是新药研发的关键部分。本研究利用体外PDLSC/CMC二维在线联用生物亲和色谱分析方法，首次快速高效地筛选、分离出苦豆子、甘草、杜仲与牙周膜细胞色谱柱未形成保留色谱峰。结果说明这3种药物不能在人牙周膜细胞亲和富集，不能在口腔局部更好保留而发挥药理作用。而三七、丹参、续断提取成分与牙周膜细胞色谱柱能形成保留色谱峰，说明利用固定相包覆的牙周细胞膜表面特定活性膜受体与这3种药物配体之间有“受体-配体”亲和靶点。本研究为治疗口腔牙周炎的中药研发提供了新的理论基础，我们可以根据这3种药物与牙周膜结合的机理及是否发挥特异药效进一步研究，也为利用特异性受体高表达细胞膜色谱能够特异地从中药中识别目标组分，从而为相关受体的药物研究及特异性筛选用于治疗疾病的中药活性化合物提供新的思路和方法。