ECRG4在结直肠癌中的表达及临床意义

邓燕红，游颜杰，郭建阳，唐媛媛，陈 雯，高瑞萍

结直肠癌(CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，是胃肠道肿瘤的第二位[1]。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，其发病率呈逐年上升的趋势。早期结直肠癌因临床症状不明显，早期发现较为困难，有很多患者在终末期才被确诊。而临床上因手术操作的局限性、放化疗的毒副作用及耐药性一直是制约该疾病诊治的主要原因。因此，确定一个有效的结直肠癌药物靶点至关重要。食管癌相关基因4(ECRG4)，又称C2orf40或Augurin，其基因定位于人染色体2q12.2(Genbank accession No.AF325503)，编码全长由148个氨基酸残基组成的分泌型蛋白质[2]，是从人正常食管组织中鉴定和克隆的一个抑癌基因。目前一些研究表明,ECRG4作为一种潜在的抑癌基因可以抑制食管癌、食管鳞癌、头颈部鳞状细胞癌、人脑胶质瘤、鼻咽癌、膀胱癌及乳腺癌的肿瘤发展[1,3-7]。另一项研究表明,ECRG4下调能抑制结肠癌细胞生长并诱导其凋亡[8]。本研究应用免疫组织化学法检测ECRG4在结肠癌临床标本中的表达状态，旨在探讨其与临床病理参数的相关性及患者的生存期关系。

1 资料与方法

1.1 临床样本：购买上海芯超公司结肠癌组织石蜡包埋标本组织芯片，包括2007年1月-2010年6月手术切除并经病理确诊的98例结肠癌组织，样本来源于上海市肿瘤疾病研究所。依据国际抗癌联盟(International Union Against Cancer)pTNM分期：Ⅰ期33例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例，Ⅵ期28例；病理组织学分型：Ⅰ期35例，Ⅱ期44例，Ⅲ期19例。患者术前未接受任何放化疗和生物治疗。对所有患者资料进行电话生存随访截至2018年5月，其中死亡49例。

1.2 主要试剂：兔抗人ECRG4多克隆抗体购自英国Abcam公司，EnVision两步法试剂盒购自上海长岛生物技术有限公司，DAB 试剂购自中山金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色：手术切除标本固定在10%福尔马林缓冲液中，石蜡包埋，二甲苯逐级脱蜡3次，每次10 min;梯度酒精回水，室温下用0.3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性30 min。为了提取抗原，组织切片在121 ℃柠檬酸盐缓冲液(10 mM/L，pH 6.0)中高压灭菌10 min。用ECRG4抗体(工作浓度为1∶100)孵育，以EnVision二部法进行染色。ECRG4抗体工作浓度为1∶100，DAB显色，苏木素核染色，盐酸分化，脱水透明后封片。以PBS代替ECRG4抗体作为实验空白对照。

1.4 结果判定：标本由病理科医师采用单盲法按照文献判定标准阅片，即阳性表达定位于胞浆，出现明显的黄色至棕黄色颗粒。免疫组化染色通过结合癌区的强度(0，无染色；1，弱染色；2，中度染色；3，强染色)和分布(0，阴性；1，1%～25%的肿瘤细胞染色；2，26%～50%的肿瘤细胞染色；3，51%～75%的肿瘤细胞阳性；4，76%～100%以上的肿瘤细胞)进行评估。如果以染色强度与染色阳性细胞百分率的乘积为总评分进行分组，≤ 6分为抗体低表达组，> 6分为抗体高表达组。

1.5 统计学方法:采用SPSS 17.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，生存期比较采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织中ECRG4表达与临床病理特征的关系：结肠癌组织中ECRG4蛋白主要表达于结肠癌细胞的细胞浆中(图1，目录后)。97例临床样本中，有49例为ECRG4呈高表达(50.5%)，48例为ECRG4呈低表达(49.5%)。ECRG4蛋白的表达与病理组织学分级比较差异有统计学意义(P<0.05)。但ECRG4蛋白表达水平在结肠癌的浸润程度、淋巴结转移、远处转移以及TNM分期上其构成比差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 结肠癌组织中ECRG4表达状态与临床病理特征的关系[n(%)]

2.2 ECRG4和结肠癌预后参数的关系：Kaplan-Meier分析显示,高ECRG4高表达组的总体生存期[(67.980±4.358)个月；95%CI=59.438～76.522)]显著高于ECRG4低表达组[(40.306±4.432)个月；95%CI=31.619～48.993)]，见图2(封三)。

2.3 ECRG4和结肠癌预后的多因素生存时间分析：高ECRG4表达组是低ECRG4表达组的0.262倍，是提高生存时间的主要因素(HR=0.262，95%CI0.141～0.486；P<0.05)。此外，病理分级是结肠癌患者总生存率的重要预后指标(HR=4.058，95%CI2.381～0.486；P<0.05)。多变量Cox回归分析显示，ECRG4高表达、病理分级和TNM分期对结肠癌患者的总生存率差异有统计学意义(P<0.05)，但高ECRG4表达是结肠癌患者预后的独立保护因素(HR=0.381，95%CI0.202～0.72；P<0.05)，见表2,图3(封三)。

表2 结肠癌患者总生存率的单变量和多变量分析

3 讨论

目前，已有研究显示ECRG4在一些癌组织中是沉默的或明显的下调[3-6]，包括结肠癌，这些研究结果提示ECRG4可能作为一种抑癌基因，负调控癌细胞的增殖、侵袭、抑制肿瘤的发生发展。ECRG4由LI等人首次报道发现，在食管鳞状上皮细胞癌中ECRG4表达显著增高[3]，这一研究结果提示ECRG4是一种抑癌基因。基因组DNA 甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生发展的重要因素之一[9]。本课题组前期研究了ECRG4在鼻咽癌中的抑癌基因功能，发现基因启动子高频甲基化是造成ECRG4表达下调的重要原因[4]。TANG等人研究发现ECRG4在人乳腺癌细胞和细胞系中沉默，可能是由于启动子甲基化，ECRG4可能作为肿瘤抑制因子，抑制了细胞增殖和迁移[10]。本课题组另一研究显示，ECRG4蛋白表达缺失与乳腺癌淋巴结转移、临床分期和不良总生存期有显著相关性[5]。

本研究结果发现，ECRG4蛋白的表达在病理组织分级为Ⅰ/Ⅱ与Ⅲ有显著相关性。Cox单因素分析结果显示病理分级为Ⅲ级较Ⅰ/Ⅱ级是结肠癌患者总生存率的不利因素，也就是说结肠癌恶性程度越高的患者其生存率越低。另外，肿瘤组织TNM分期对结肠癌患者的生存率也存在着影响。本研究结果显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期较Ⅰ～Ⅱ是影响结肠癌患者总生存率的不利因素。邓鹏的研究结果也显示，胃癌组织中ECRG4下调与胃癌分化程度TNM分期密切相关[11]。结合患者预后资料进一步分析显示，ECRG4高表达结肠癌患者组的总体生存期显著高于ECRG4低表达患者组。进一步通过Cox生存回归分析显示，结肠癌患者总生存率单因素分析显示ECRG4高表达是减少相对危险度、提高生存时间的主要因素，多因素分析结果也显示ECRG4高表达是结肠癌预后的独立保护因素。本研究结果提示ECRG4可能是结肠癌的一种抑癌基因，可作为预测结肠癌患者生存的一个生物标志物。

尽管ECRG4在结肠癌组织中是低表达状态，具有潜在的抑癌活性，但这些抗肿瘤活性仍然是不清楚的。目前的研究结果显示，ECRG4基因编码的一种细胞因子/趋化因子样分泌蛋白，与上皮癌的发展和进展、细胞周期的进展和凋亡、细胞的衰老和迁移以及炎症、损伤和感染反应性有关[2]。在我们之前的研究者中发现，在食管癌、鼻咽癌中ECRG4表达的下调或缺失与启动子甲基化过度有关[4,5]。同样，在其他研究中也显示在结直肠癌、前列腺癌、胃癌中也发现了ECRG4启动子甲基化[12]。通过检测外周血ECRG4甲基化可能对这些肿瘤的诊断筛查、检测肿瘤复发转移发挥着重要作用。为更准确了解ECRG4在结肠癌发病机制中的作用，在未来还需要更深入的研究去探索。