FK506、肾功能指标及单个核细胞计数判断肾移植患者尿BKV DNA 阳性的价值

黄思聪， 石永杰， 嘉红云

（广州医科大学附属第二医院检验科，广东 广州 510260）

有研究结果显示，10%～68%的肾移植患者会因使用免疫抑制剂导致BK病毒（BK virus，BKV）被激活，其中1%～10%的患者会出现BKV相关肾病，而在发生BKV相关肾病的患者中，有50%会发生移植肾功能丧失，因此BKV是导致肾移植失败的重要因素[1]。尿BKV DNA阳性的出现时间早于血BKV DNA，因此尿BKV DNA定量检测是目前临床监测BKV激活的首选方法[2]。目前，常用的国产BKV DNA检测试剂一般使用外源性内标，不参与尿液DNA提取过程，容易忽略因核酸提取效率过低而造成的假阴性。有研究结果显示，高水平FK506[3]、淋巴细胞百分比（the percentage of lymphocyte，LYMPH%）降低[4]是促进BKV活化的风险因素，而BKV活化的肾移植患者血尿素及肌酐（creatinine，Cr）显著高于BKV阴性患者[5-7]。因此，本研究拟探讨血FK506、尿素和Cr水平及单个核细胞计数判断尿BKV DNA阳性的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年5月—2020年8月广州医科大学附属第二医院肾移植患者197例。患者移植术后使用三联免疫抑制方案：FK506+霉酚酸酯或麦考酚钠+激素，FK506用量为0.15～0.3 mg/kg、2次/d，根据血药浓度调整剂量；术后3个月，FK506靶浓度为8～9 ng/mL，用药期间每2周监测1次。按照本研究所用检测试剂的分析性能，以尿BKV DNA≥2.0×103拷贝/mL为BKV阳性组，＜2.0×103拷贝/mL为BKV阴性组。BKV阳性组患者84例，其中男58例、女26例，年龄（41.49±0.97）岁。BKV阴性组患者113例，其中男74例、女39例，年龄（41.44±1.08）岁。另选取21例术后3～6个月内多次检测尿BKV DNA，并首次出现阴性转阳性的患者进行配对比较。排除标准：（1）有恶性肿瘤及白血病病史患者；（2）患严重感染性疾病者，如人类免疫缺陷病毒感染、正处于病毒复制期的肝炎病毒感染者；（3）急性肾功能衰竭、肾功能衰竭期、尿毒症终末期患者；（4）尿崩症或少尿症患者。本研究经广州医科大学附属第二医院伦理委员会审批通过。

1.2 尿BKV DNA测定

收集所有患者的中段晨尿样本，取10 mL中段晨尿，彻底混匀后取1.5 mL，加入Eppendorf管中，12 470×g离心10 min后取沉淀。采用裂解法提取BKV DNA。采用EPOCH紫外分光光度计（美国BioTek公司）对模板进行总DNA定量，确保BKV DNA＞2 ng/mL（符合检测试剂的性能要求）。采用荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测BKV DNA载量[8]。如检测结果为阴性，由2名检验人员进行复检，以保证结果准确。检测仪器为ABI 7500荧光定量PCR扩增仪，试剂盒购于北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，严格按试剂说明书要求进行操作。

1.3 血FK506、尿素、Cr测定及单个核细胞计数

采集所有对象静脉血6 mL，其中2 mL采用乙二胺四乙酸二钾（ethylenediaminetetraacetic acid-K2，EDTA-K2）抗凝，用于FK506水平、LYMPH%、淋巴细胞绝对值（the absolute value of lymphocyte，LYMPH#）、单核细胞百分比（the percentage of monocyte，MO%）及单核细胞绝对值（the absolute value of monocyte，MO#）检测；另4 mL采用肝素抗凝，用于尿素、Cr检测。采用Viva-E血药浓度监测仪（德国西门子公司）检测FK506水平，试剂购自珠海丽珠试剂有限公司。采用XN-1000血液分析仪（日本Sysmex公司）及配套试剂检测LYMPH%、LYMPH#、MO%、MO#。采用cobas 8000全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司）及配套试剂检测尿素、Cr水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验。呈非正态分布的计量数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney检验及Wilcoxon配对检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价各项指标判断BKV DNA阳性的效能。正态分布数据的相关性采用Pearson相关分析，非正态分布数据的相关性采用Spearman相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BKV阳性组与BKV阴性组各项指标的比较

BKV阳性组FK506、尿素、Cr水平高于BKV阴性组（P＜0.05），2个组之间年龄、性别、LYMPH%、LYMPH#、MO%、MO#差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 BKV阳性组与BKV阴性组各项指标的比较

2.2 血FK506、尿素、Cr与尿BKV DNA载量的相关性分析

相关性分析结果显示，尿BKV DNA载量与血FK506水平呈正相关（r=0.466，P＜0.001），与尿素及Cr均无相关性（r值分别为0.157、0.156，P＞0.05）。见图1。

图1 血FK506、尿素、Cr与尿BKV DNA的相关性

2.3 血FK506、尿素、Cr判断尿BKV DNA阳性的效能

ROC曲线分析结果显示，血FK506、尿素、Cr判断尿BKV DNA阳性的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.685、0.581、0.606，最佳临界值分别为7.05 ng/mL、7.20 mmol/L、100.5 μmol/L，敏感性分别为58.3%、71.4%、83.3%，特异性分别为74.3%、46.0%、38.1%。见图2。

图2 血FK506、尿素、Cr判断尿BKV DNA阳性的ROC曲线

2.4 同一肾移植患者尿BKV DNA首次阴性转阳样时FK506、尿素和Cr水平变化

21例肾移植患者术后首次出现尿BKV DNA阴性转阳性的时间为4（2～6）个月，见图3。

图3 肾移植患者术后首次出现尿BKV DNA阴性转阳性的时间分布

与尿BKV DNA阴性时比较，同一肾移植患者首次出现尿BKV DNA阳性时的FK506水平明显升高（P＜0.001），而尿素及Cr水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 同一肾移植患者尿BKV DNA首次阴性转阳性时FK506、尿素、Cr的变化

3 讨论

BKV属于人类多瘤病毒中的一个亚型，感染后多以潜伏状态存在，在普通人群中的隐性感染率高达80%，通常无明显临床症状。初次感染后，BKV常潜伏于肾小管上皮细胞及尿路移行上皮细胞内，健康人并不致病。但对于肾移植术后患者，由于免疫抑制剂的使用，免疫功能被抑制而导致BKV再激活。BKV的高水平复制会导致被感染细胞出现松解和破坏，进而发生组织炎性细胞浸润，肾组织结构被破坏，是造成肾移植失败的重要原因之一[5]。如果能在BKV激活早期使用西多福韦、来氟米特和丙种球蛋白治疗[9]，或及时调整免疫抑制剂的使用[10]，是逆转移植肾功能丧失的关键，因此对BKV再激活的早期诊断尤为重要。BKV的检测方法主要有尿液细胞学检测、电子显微镜检测、尿液病毒衣壳蛋白1 mRNA检测、定量PCR、病理穿刺组织活检等，这些方法各有优缺点。血、尿BKV DNA定量检测是目前临床监测BKV激活的首选方法[2]。

病毒核酸提取有异于组织及细胞，后者可通过检测核酸总浓度或管家基因监测扩增前的提取质量，但针对临床样本病毒检测扩增前的质量保证，现阶段尚无专家共识。临床上用于尿BKV DNA检测的样本基本采用中段晨尿，尽量排除随机尿中病毒浓度的不稳定性。国产商品化试剂对BKV靶基因的检测已较为成熟，具有较高的灵敏度和特异性，但针对尿BKV DNA的提取仍有一定的局限性：目前大部分试剂使用的外源性内标是直接加到PCR扩增体系中的，只能监测扩增是否受抑制，而未对核酸提取过程进行监控；尿液的提取步骤主要是高速离心后弃上清，取沉淀裂解。澄清尿样由于沉淀不明显，吸取上清液时极易把沉淀中的少量细胞或病毒颗粒一并吸取掉，导致扩增结果出现假阴性。而在临床实际工作中又无法对阴性样本逐一复查。因此，本研究拟寻找与肾移植患者尿BKV DNA高度相关的血液检验指标作为参考，当患者尿BKV DNA为阴性，而该指标高于对应的阳性临界值时，提示样本存在假阴性的风险较高。根据既往针对肾移植患者的研究，高水平的FK506[3，11]及LYMPH%降低[3]是促进BKV活化的风险因素，BKV活化患者血尿素水平高于阴性患者[5，7]，BKV血症患者Cr水平显著增高[5-6]。因此，本研究探讨了血FK506、单个核细胞计数、尿素及Cr对肾移植患者尿BKV DNA阳性的判断价值。

细胞免疫在肾移植患者抑制BKV激活的机制中起关键作用，BKV特异性T细胞是主要的功能细胞[12]。本研究结果显示，在肾移植患者中，尿BKV DNA阳性者与BKV DNA阴性者比较，LYMPH%、LYMPH#、MO%、MO#差异均无统计学意义（P＞0.05）。原因可能是肾移植患者一般会在BKV血症时才表现出特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞减少[13]，而BKV在尿液中的检出时间比在血液中的检出时间早约1个月[2]，在尿BKV DNA阳性时，血液单个核细胞不一定出现明显变化，因此对早期尿BKV再激活的判断能力有限。范宇等[14]的研究结果显示，肾移植患者初次发现BKV尿症时，血Cr水平显著高于基础Cr值。本研究结果显示，尿BKV DNA阳性肾移植患者血尿素及Cr水平虽然稍高于尿BKV DNA阴性肾移植患者，但尿素及Cr判断尿BKV DNA阳性的AUC分别仅为0.581及0.606，且与尿BKV DNA载量无相关性。肾移植患者首次出现尿BKV DNA由阴性转阳性时，血尿素及Cr水平的变化并不明显。原因可能是BKV造成的肾功能损伤是一个持续、缓慢的过程，通常只有当患者出现BKV尿症（尿BKV DNA＞1.0×107拷贝/mL），甚至发展成BKV血症时，才出现肾功能急剧衰退[12]。因此，血尿素及Cr对判断肾移植患者尿BKV DNA阳性的价值较低。

目前，临床最常用的肾移植后免疫抑制方案是以钙调磷酸酶抑制剂为主的三联免疫抑制方案，即FK506或环孢素A+霉酚酸酯或麦考酚钠+激素，其中环孢素A对BKV有一定的抑制作用[15]，有利于降低BKV活化的风险[16]，霉酚酸酯或麦考酚钠与BKV活化无明显相关性[11]。FK506作为主流免疫抑制剂，目前被普遍认为是增加BKV活化风险的独立危险因素。血FK506水平的降低有利于BKV血症的消退，且能明显改善早期无急性排斥或移植肾功能丧失的BKV相关肾病患者的预后[3-4]。体外研究结果显示，FK506可通过肾小管上皮细胞内的FK506结合蛋白12促进BKV的活化与复制[15，17]。本研究结果显示，肾移植患者尿BKV DNA载量与血FK506水平呈正相关（r=0.466，P＜0.001），与文献报道[11]相符。另外，肾移植患者血FK506水平在首次出现尿BKV DNA阳性时明显增高，本研究ROC曲线分析结果提示，当肾移植患者血FK506＞7.05 ng/mL时，尿BKV DNA阳性的可能性较大，若此时该份样本尿BKV DNA呈阴性，再次收集样本进行复查，或许有助于减少尿BKV DNA假阴性的发生。

综上所述，FK506在判断肾移植患者尿BKV DNA阳性中有一定价值。由于FK506个体药物代谢差异较大，因此本研究单纯以血FK506水平作为参考有一定局限性，这也可能是其AUC未达理想水平的原因。对此，有学者提出以个体代谢率（血药浓度/日给予量）评估FK506对BKV活化的风险可能更为合理[18]。另外，由于本研究用于配对比较的例数仅为21例，样本量较小，因此后续将继续扩大样本量，并通过随访搜集更完整的临床资料，进一步完善本研究的结论。