栝楼桂枝汤对氧糖剥夺诱导的HT22细胞损伤保护作用机制研究

杨劲博，朱晓勤，胡海霞*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122）

脑卒中是全球第二大死亡原因［1］，据其发病机制可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中占所有脑卒中病例的87%［2］。目前脑卒中发生的机制较为复杂，兴奋毒性、氧化应激和炎症在内的多种机制都可以引起脑损伤，诱导神经细胞凋亡。针对脑卒中的治疗，溶栓治疗是缺血性脑卒中急性期最为有效的治疗手段之一，静脉溶栓组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）是唯一获得美国食品和药物管理局（FDA）批准的药物［3］。然而，rt-PA的治疗时间窗口狭窄，仅为脑卒中发生后4.5 h，仅有3%～5%的患者能够时得到救治，显著降低了其对缺血性脑卒中的疗效［4］。其他药物如谷氨酸受体抑制剂阿替加奈、钙通道抑制剂尼莫地平、氧自由基清除剂及抗氧化剂依达拉奉等［5］，在临床前实验中都已证实能够抑制神经细胞凋亡，改善神经细胞状态，但在临床使用中疗效欠佳。其中主要原因在于这些药物治疗作用靶点较为单一，仅针对整个脑卒中病程中的单一病理过程和发病机制，而脑卒中是多种病理过程共同作用的结果。近年来，中药复方因其具有多组分协同，可在多系统、多层次、多靶点上发挥整体治疗作用，且毒副作用小、成本低，已成为治疗脑卒中的研究热点。栝楼桂枝汤（Gualou Guizhi decoction，GLGZD）出自东汉末年张仲景《金匮要略》，已有研究表明栝楼桂枝汤可以减轻脑缺血再灌注损伤［6-8］，课题组前期实验也已证明GLGZD可通过多途径、多机制缓解神经细胞损伤［9］，发挥神经保护作用，但其作用机制尚未深入探讨。基于此，本研究以小鼠海马HT22神经细胞为切入点，从减轻神经元凋亡角度探讨栝楼桂枝汤对脑卒中神经保护作用机制，为临床用药提供理论依据。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料 小鼠海马神经元细胞HT22（上海泽叶生物科技有限公司，批号：C8339）；DMEM高糖培养基（美国Hyclone公司，批号：SH30022）；EBSS无糖培养基（美国S igma公司，批号：M5017）；PBS缓冲液（美国Hyclone公司，批号：SH30256）；胎牛血清（批号：10099141）、胰酶消化液（批号：15050057）均购自美国ThermoFisher公司；栝楼桂枝汤药材购自福建中医药大学国医堂；CCK-8试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0218-50）；ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：ml003167）；细胞凋亡DAPI染色试剂盒（批号：KGA215-50）、Caspase-3荧光检测试剂盒（批号：KGA202F）均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；BCA蛋白定量试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：C05-02001）。

1.2 实验仪器 超净工作台（苏州安泰仪器设备有限公司）；酶标仪（美国Bio-Tek公司）；CO2培养箱（香港力康仪器设备有限公司）；倒置显微镜（日本Nikon公司）；低速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；细胞低氧培养工作站（英国Don Whitley公司）；恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂）；细胞相差荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）。

2 实验方法

2.1 栝楼桂枝汤水提液制备 取天花粉30 g，白芍15 g，生姜9 g，甘草6 g，桂枝9 g，大枣12枚混合，5倍量水加热回流2次，每次1 h，过滤，滤液合并，旋转蒸发仪减压浓缩，真空干燥成干浸膏，-20℃冰箱冻存备用。使用前用培养基将干浸膏稀释成50 mg／mL液体，过滤后4℃冰箱保存备用。

2.2 HT22细胞培养 将小鼠海马神经元HT22细胞用完全培养基［含10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（青链霉素）的DMEM培养基］于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养备用。细胞贴壁生长至80%，用0.25%胰酶消化并传代培养，用于后续实验。

2.3 实验分组和处理 HT22细胞分为正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。正常组：HT22细胞在完全培养基，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。模型组：氧糖剥夺／再灌注（OGD／R）诱导损伤，完全培养基培养24 h后，将完全培养基更换无糖EBSS培养基后，置于1%O2、5%CO2、94%N2低氧培养工作站培养90 min，此即为氧糖剥夺过程；再将无糖EBSS培养基更换为完全培养基，放置于37℃、5%CO2恒温培养箱复氧培养24 h，复氧复糖，此过程即为再灌注过程。HT22细胞经OGD／R模型损伤后，细胞生长活力明显下降，活力在50%～60%左右。正常HT22细胞轮廓清晰，贴壁牢固，立体感强，而OGD／R损伤后，细胞突起皱缩、变圆，贴壁状态较差，部分细胞漂浮在培养基中，甚至死亡。低、中、高剂量组：在OGD／R模型复氧复糖过程中分别于完全培养基中加入50、100、200μg／mL GLGZD药液。

2.4 CCK-8法筛选GLGZD药物最佳干预浓度 取上述5组HT22细胞，按照1×105个／mL密度，接种在96孔板，每孔100μL，各组细胞处理结束后，每孔加入10μL CCK-8毒性检测液，置于培养箱中继续培养4 h后，使用酶标仪于波长450 nm处检测OD值，根据公式计算各组细胞生长活力，实验重复3次。CCK-8实验显示：氧糖剥夺再灌注后，HT22细胞生长活力降至57.36%（见模型组），说明模型建立成功；而使用低、中、高不同剂量（50、100、200μg／mL）GLGZD干预，则可显著恢复细胞的生长活力，并随着剂量的加大，细胞活力增加，呈现剂量性依赖，高剂量组细胞活力达到85.43%，最佳药物浓度为200μg／mL，见图1。故后续实验以高剂量组浓度200μg／mL作为药物干预浓度。

图1 各组细胞生长活力结果图

2.5 DAPI染色检测HT22细胞凋亡 DAPI（4，6-Diamidino-2-phenylindole，4，6-二氨基-2-苯基吲哚）是一种DNA染料，对细胞膜有半通透性，可以透过细胞与DNA产生非嵌入式结合，发出蓝色荧光。HT22细胞分为正常组、模型组、GLGZD组。正常组与模型组细胞处理同“2.4”，GLGZD组在复氧复糖过程于完全培养基中加入200μg／mL GLGZD药液。按照1×105个／mL密度接种于6孔板，每孔2 mL。制备1.5μg／mL DAPI工作液，各组细胞处理结束后吸弃6孔板中的培养基，PBS清洗，加入500μL DAPI工作液，37℃避光15 min，50μL甲醇漂洗，加入50μL Buffer A，荧光显微镜下以340／380 nm紫外光激发，×200、×400显微镜观察细胞凋亡情况。

2.6 荧光定量法检测Caspase-3活性 HT22细胞分组和处理同“2.4”，干预完成后裂解细胞，收集细胞后加入100μL冰冷Lysis Buffer，冰上裂解30 min，其间涡旋振荡3～4次，每次10 s，4℃，10 000 r／min离心1 min。小心吸取上清液（含裂解的蛋白质）转移至新的管中，进行BCA蛋白定量，于波长562 nm处测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。根据Caspase-3活性检测试剂盒说明书，用荧光酶标仪测定荧光强度（激发波长＝485 nm，发射波长＝535 nm），通过公式计算Caspase-3活性荧光强度比值。

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。计量资料属正态分布的以（±s）表示，组间数据比较采用单因素方差分析，非正态分布采用非参数检验；计数资料采用χ2检验。

3 结 果

3.1 栝楼桂枝汤对HT22细胞凋亡的影响 正常细胞的核形态呈圆形，边缘清晰，染色均匀；凋亡细胞的膜通透性增加，细胞核边缘不规则，染色体浓集，荧光着色较重，且细胞核固缩，核小体碎片增加。DAPI染色结果显示：正常组细胞形态正常，无损伤，模型组呈现明显的凋亡形态，GLGZD组细胞凋亡形态有所恢复，见图2，说明GLGZD可以抑制神经元凋亡。

图2 3组细胞凋亡形态DAPI染色结果图

3.2 栝楼桂枝汤对Caspase-3活性的影响 Caspase-3是凋亡的执行因子，通过多种途径介导细胞的凋亡［10-11］。图3所示：模型组Caspase-3活性荧光强度比值明显增强，GLGZD组Caspase-3活性荧光强度比值虽未达到正常水平，但是较模型组明显下降，说明GLGZD可通过降低Caspase-3活性水平，抑制凋亡，减轻神经细胞损伤。

图3 3组细胞Caspase-3活性检测结果图

4 讨 论

本研究通过CCK-8实验证明：氧糖剥夺再灌注后，在各种损伤机制作用下，HT22神经生长活力迅速下降，细胞受到明显损伤；在GLGZD作用下，HT22细胞的生长活力明显上升，其中以200μg／mL药物浓度最佳，初步证实GLGZD对损伤HT22细胞的保护作用。而DAPI染色实验显示：模型组细胞出现明显的凋亡形态，染色体浓集，细胞核边缘不规则，荧光着色较重；经过GLGZD干预后，细胞凋亡形态虽未恢复至完全正常的细胞形态，但较模型组细胞形态有了明显改善，细胞形态较为完整，染色质均一。细胞凋亡［12］是指存在于大多数生物体内由基因调控的细胞自主、有序的死亡过程，凋亡具有独特的形态学和生物化学特征，如细胞质膜泡状化、胞质浓缩、染色质凝集、DNA片段化等，GLGZD可以通过改善细胞的凋亡形态，进而起到神经细胞保护的作用。Caspase-3是凋亡的最终执行者［13］，在凋亡级联反应中居于核心地位，Caspase-3正常情况下以无活性的酶原形式存在，在凋亡级联反应下活化为Cleaved Caspase-3，抑制Caspase-3活化可抑制细胞凋亡。当细胞遭受OGD／R损伤后，Caspase-3活性明显升高并活化，启动凋亡级联反应。经GLGZD干预后，Caspase-3活性虽未降至正常水平，但是较模型组有了明显下降，故GLGZD是通过抑制细胞凋亡关键蛋白Caspase-3的活性水平，减轻凋亡，从而达到神经保护作用。综上所述，GLGZD对卒中后神经细胞损伤起到保护作用，机制主要是抑制凋亡关键蛋白Caspase-3活化，减轻凋亡损伤。

本研究主要探讨GLGZD对卒中后HT22细胞生长活力和凋亡方面的影响，为其临床治疗提供科学依据。但是卒中后神经细胞损伤受到众多机制的调控，凋亡是其中一种，GLGZD对卒中后神经细胞保护作用是否涉及其他机制，有待进一步研究。