升降利咽合剂提取工艺研究

邱水生，罗花彩，黄 燕，潘旭东

（福建中医药大学附属人民医院，福建 福州350004）

加味升降散为我院临床验方，是在清·杨璇《伤寒温疫条辨》所收载的升降散处方基础上加减而成，处方由淡豆豉、焦栀子、连翘、薄荷、僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄等组成，具有升清降浊、行气散瘀、清热解毒、利咽消肿的功效，可有效治疗咽喉肿痛［1］。加味升降散临床疗效确切，但因汤剂使用不便，我院拟将其开发为升降利咽合剂，申请院内制剂批文，便于临床使用。本研究采用正交试验对处方中姜黄、薄荷挥发油的水蒸气蒸馏法提取工艺进行考察，采用星点设计-响应面法对升降利咽合剂的水提工艺进行考察，优选升降利咽合剂的提取工艺，以期为升降利咽合剂的深入开发提供参考。

1 仪 器

Sartorius CPA225D电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Dionex ULtimate 3000高效液相色谱仪和UV检测器（美国DIONEX公司）；KQ-500DE超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

2 试 药

栀子苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110749-201919，含量：97.1%）；连翘苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110821-201816，含量：95.1%）；僵蚕（广东汇群中药饮片股份有限公司，产地：浙江省衢州市，批号：2019020101）；蝉蜕（广东汇群中药饮片股份有限公司，产地：安徽省亳州市，批号：190201）；姜黄（安徽协和成药业饮片有限公司，产地：四川省乐山市，批号：19011103）；大黄（安徽协和成药业饮片有限公司，产地：甘肃省陇南市，批号：19091107）；淡豆豉（亳州市沪谯药业有限公司，产地：安徽省黄山市，批号：1905290362）；焦栀子（安徽协和成药业饮片有限公司，产地：江西省抚州市，批号：19071735）；连翘（安徽协和成药业饮片有限公司，产地：山西省运城市，批号：19122503）；薄荷（安徽协和成药业饮片有限公司，产地：安徽省阜阳市，批号：20030205）。以上中药饮片购自福建承创堂中药有限公司，由福建中医药大学附属人民医院林雄主任中药师鉴定符合《中华人民共和国药典（一部）》2020版规定。乙腈（色谱纯，上海麦克林生化有限公司）；其余试剂为分析纯，水为纯化水。

3 方法与结果

3.1 总提取工艺 处方中姜黄、薄荷二味饮片，用水蒸气蒸馏法提取挥发油备用，药液滤取备用，药渣与处方中其余饮片一起进行水提。水提液与上述药液合并，浓缩至一定量后，冷却，加入挥发油，加纯化水定容。

3.2 挥发油提取工艺研究

3.2.1 薄荷、姜黄饮片吸水率的考察 称取5倍处方量的薄荷、姜黄饮片共75 g，置1 000 mL具塞量筒中，加入10倍量水，密塞，静置6 h，滤过［2］，量取滤液体积，按吸水率＝（加水量－滤液量）／饮片质量×100%计算，结果吸水率为246%。

3.2.2 挥发油提取与测定 取5倍处方量薄荷、姜黄饮片共75 g，置2 000 mL烧瓶中，加入10倍量水，补足吸水量，浸泡，连接挥发油提取器与回流冷凝管，采用水蒸气蒸馏法提取，按2020版《中华人民共和国药典（四部）》［3］中挥发油测定法甲法进行测定。自冷凝管上端加水使水充满挥发油测定器的刻度部分，并溢入烧瓶时为止；电热套缓缓加热至沸，开始计时，保持相应时间，停止加热，放置1 h，读取挥发油量。

3.2.3 正交实验设计 根据预实验结果，以提取时间（A）、浸泡时间（B）、加水量（C）为考察因素，每个因素选取3个水平进行正交试验，以挥发油量为考察指标，并对结果进行方差分析，因素水平见表1，实验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表2直观分析和表3方差分析结果表明：以挥发油量为考察指标时，各因素对挥发油量影响大小的顺序为A＞B＞C，其中因素A对试验结果具有显著性影响（P＜0.05），故选择A3；因素B和C未对试验结果产生显著性影响（P＞0.05），选择均值最大。故最佳提取工艺为A3B2C2，即饮片加入8倍量水且补足吸水量，浸泡1 h，水蒸气回流提取6 h。

3.2.4 试验验证 称取5倍处方量的姜黄和薄荷饮片共3份，按照最优的提取工艺进行验证，结果所得挥发油量分别为1.10、1.12、1.15 mL，平均值为1.12 mL，可知该方法稳定可行。

3.3 升降利咽合剂水溶性成分提取工艺研究

3.3.1 除薄荷、姜黄外其他饮片吸水率的考察 称取处方量除薄荷、姜黄外的其他饮片共60 g，置1 000 mL具塞量筒中，加入10倍量水，密塞，静置6 h，滤过，量取滤液体积。按吸水率＝（加水量－滤液量）／饮片质量×100%计算，结果吸水率为220%。

3.3.2 水提液的制备 称取2倍处方量饮片，薄荷、姜黄两味饮片加入8倍量水，并补足吸水量，浸泡1 h，水蒸气蒸馏提取6 h，收集挥发油，蒸馏后的水溶液滤取备用；薄荷、姜黄药渣与其余饮片加入10倍量水，补足吸水量，第一次煎煮前浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1 h；合并滤液与蒸馏后水溶液，浓缩至150 mL，静置24 h，离心，浓缩至120 mL，待药液冷却后加入挥发油，搅匀，加纯化水定容至150 mL。

3.3.3 栀子苷含量测定

3.3.3.1 栀子苷测定色谱条件 色谱柱：EcoPak 120 C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：乙腈-水（13∶87）；流速：1.0 mL／min；检测波长：237 nm；进样量：10μL。理论塔板数按栀子苷计，应不低于4 500。

3.3.3.2 对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇溶解配制成0.098 1 mg／mL对照品溶液，备用。

3.3.3.3 供试品溶液的制备 精密吸取药液1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密称定；超声处理30 min，精密称定，加甲醇补足减失的重量，药液移至离心管，离心30 min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得。

3.3.3.4 升降利咽合剂缺焦栀子阴性对照溶液制备 按处方比例称取2倍量除焦栀子以外的其他饮片，按“3.3.2”项下工艺提取，再按“3.3.3.3”项下制备，即得。

3.3.3.5 专属试验 取栀子苷对照品溶液、“3.3.3.3”项下供试品溶液、“3.3.3.4”项下缺焦栀子阴性对照溶液进样，按“3.3.3.1”项下色谱条件分析，结果见图1。图1可见阴性对照溶液在栀子苷色谱峰保留时间处无吸收，表明处方中其他药味无干扰。

图1 栀子苷HPLC色谱图

3.3.3.6 线性关系的考察 精密吸取“3.3.3.2”项下栀 子 苷 对 照 品 溶 液6、8、10、12、14、16、18μL，按“3.3.3.1”项下色谱条件进行测定。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得标准曲线方程。栀子苷：Y＝21.659X＋2.228（r＝0.999 5），结果表明栀子苷在0.588 6～1.765 8μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.3.3.7 精密度试验 精密吸取“3.3.3.2”项下栀子苷对照品溶液，按“3.3.3.1”项下色谱条件连续进样6次，记录栀子苷的峰面积，RSD为0.57%，表明精密度良好。

3.3.3.8 重复性试验 按“3.3.3.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，按“3.3.3.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算样品栀子苷含量。结果：栀子苷平均含量为3.174 9 mg／mL，RSD为1.96%，表明本方法重复性良好。

3.3.3.9 稳定性试验 取“3.3.3.3”项下供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，按“3.3.3.1”项下色谱条件进行测定，记录栀子苷的峰面积，RSD为1.39%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.3.3.10 加样回收率试验 取已知浓度的待测溶液0.5 mL置25 mL量瓶中，精密加入1.802 1 mg栀子苷对照品，再按“3.3.3.3”项下制备供试品溶液，按“3.3.3.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算样品含量，计算回收率，结果见表4。

3.3.4 连翘苷含量测定

3.3.4.1 色谱条件 色谱柱：EcoPak 120C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：乙腈-水（25∶75）；流速：1.0 mL／min；检测波长：277 nm；进样量：10μL。理论塔板数按连翘苷计，应不低于4 000。

3.3.4.2 对照品溶液的制备 精密称定连翘苷对照品适量，加甲醇溶解配制成0.190 2 mg／mL对照品溶液，备用。

3.3.4.3 供试品溶液的制备 精密吸取药液2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密称定；超声处理30 min，精密称定，加甲醇补足减失的重量，药液移至离心管，离心30 min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，即得。

3.3.4.4 升降利咽合剂缺连翘阴性对照溶液制备

按处方比例称取2倍量除连翘以外的其他饮片，按“3.3.2”项下工艺提取，再按“3.3.4.3”项下制备，即得。

3.3.4.5 专属试验 取连翘苷对照品溶液、“3.3.4.3”项下供试品溶液、“3.3.4.4”项下缺连翘阴性对照溶液进样，按“3.3.4.1”项下色谱条件分析，结果见图2。图2可见阴性对照溶液在连翘苷色谱峰保留时间处无吸收，表明处方中其他药味无干扰。

图2 连翘苷HPLC色谱图

3.3.4.6 线性关系的考察 精密吸取“3.3.4.2”项下连翘苷对照品溶液4、6、8、10、12、14μL，按“3.3.4.1”项下色谱条件进行分析。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程。连翘苷：Y＝10.825X＋0.364（r＝0.999 8）。结果表明连翘苷在0.760 8～2.662 8μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3.3.4.7 精密度试验 精密吸取“3.3.4.2”项下连翘苷对照品溶液，按“3.3.4.1”项下色谱条件连续进样6次，记录连翘苷的峰面积，RSD为0.62%，表明精密度良好。

3.3.4.8 重复性试验 按“3.3.4.3”供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，按“3.3.4.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算样品连翘苷含量。结果：连翘苷平均含量为0.737 8 mg／mL，RSD为1.32%，表明本方法重复性良好。

3.3.4.9 稳定性试验 取“3.3.4.3”项下供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，按“3.3.4.1”项下色谱条件进行测定，记录连翘苷的峰面积，RSD为1.18%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.3.4.10 加样回收率试验 取已知浓度的待测溶液1 mL，分别取精密加入0.370 9 mg连翘苷对照品，按“3.3.4.3”项下制备供试品溶液，按“3.3.4.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算样品含量，计算回收率，结果见表4。

表4 栀子苷、连翘苷加样回收率试验结果

3.3.5 干浸膏率的测定 取提取液25 mL于干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，至105℃烘箱中干燥3 h［4］，取出置干燥器冷却至室温，称重并计算干浸膏率。

3.3.6 星点设计-响应面法实验与结果 因提取次数为非连续性变量，回归处理较困难，所以结合传统汤剂实际煎煮次数及预实验结果，固定提取次数为2次。选取提取时间（A）和加水量（B）为考察因素，每个因素确定5个水平，采用Design Expert 8.0统计软件，以栀子苷含量、连翘苷含量、干浸膏率的综合评分（Y）为响应值，进行星点设计-响应面法优化实验，选取最佳提取工艺参数［5］。提取因素与水平见表5，实验设计及结果见表6。

表5 升降利咽合剂水提部位提取因素与水平表

表6 升降利咽合剂水提部位提取实验设计与结果

3.3.7 模型拟合及方差分析 通过Design-Expert 8.0软件对表6数据进行处理，以综合评分为指标进行二项拟合，得到方程：Y＝46.594 81＋27.732 04A＋4.638 27B＋1.246 67AB－15.873 00A2－0.242 03B2（r＝0.932 1，P＜0.01），方差分析见表7。由表7可知，模型具有非常显著性差异（P＜0.01），而失拟项无显著性差异（P＞0.05），表明模型的非线性拟合效果良好，能比较准确地预测实际情况。

3.3.8 升降利咽合剂水溶性成分提取工艺的确定

根据回归方程，绘制相应的三维响应曲面图、二维等高图，见图3、图4。根据星点设计－响应面法试验结果，升降利咽合剂水提液最优提取工艺为加入13.16倍水，煎煮1.39 h。综合考虑经济成本及后期大规模生产的可行性，确定升降利咽合剂水提液最优工艺为加入13倍水，煎煮80 min，煎煮2次。

图3 水溶性成分提取的三维响应曲面图

图4 水溶性成分提取的二维等高图

3.3.9 验证实验 依照星点设计－响应面法试验设计优选的最佳提取工艺进行验证，平行3次，测定栀子苷含量、连翘苷含量、干浸膏率，并计算综合评分，结果见表8。预测值与实测值偏差较小，可知所建立模型预测性、优化工艺重复性良好，具有可行性。参考文献［6］，计算公式：

表8 验证实验结果

4 讨 论

加味升降散在汤剂煎煮过程中，含有挥发性成分饮片如薄荷虽然后入，但相应挥发性成分亦只是少部分存在于药液中，大部分挥发损失。故在将其改为升降利咽合剂时，生产工艺设计中先提取薄荷、姜黄所含挥发油，留取滤液，药渣与剩余饮片再一并提取，滤液合并，浓缩后加入挥发油，尽最大力度保存药用成分，以达到更好的疗效。

本试验采用正交设计实验优选挥发油的提取工艺，以浸泡时间、提取时间、加水量为考察因素，以挥发油量为考察指标；采用星点设计-响应面法优选升降利咽合剂的水提工艺，以加水量、提取时间为考察因素，测得栀子苷含量、连翘苷含量及干浸膏率，并对此3个指标进行加权综合评分，以综合评分为评价指标，最终确定升降利咽合剂的最佳提取工艺为：加入8倍薄荷、姜黄饮片量的水，补足吸水量，浸泡1 h，水蒸气回流提取6 h，收集挥发油，药液滤取留用；药渣与其余饮片一起进行水提，加入13倍饮片量的水，补足吸水量，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次80 min；水提液与上述药液合并，浓缩至一定量后，冷却，加入挥发油，加纯化水定容。对生产工艺进行验证，结果表明本工艺经济、合理、重现性好，适用于规模化生产。