基于肾脏足细胞自噬探讨苏木提取物对Heymann肾炎模型小鼠的肾保护作用

龚一萌，郑佳新，叶方泽，张春戬，李 莹，尚 婧，卢旺洁，郭 强，田 甜

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

膜性肾病(membranous nephropathy，MN)是以肾小球基底膜上皮细胞下免疫复合物沉积伴基底膜弥漫增厚为病理特征的一组疾病，临床以无症状蛋白尿或肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)为主要表现，是导致肾小球疾病并逐步发展为终末期肾脏病的常见原因之一[1]。近年来，我国膜性肾病在肾脏疾病谱中所占比率呈快速上升趋势，已成为原发性肾小球疾病中增长速率最快的疾病[2]。因此积极寻找能够有效治疗膜性肾病的药物意义重大。本课题组在前期研究中发现原苏木素A对C5b-9介导的足细胞损伤有显著的保护作用，可能与多种生物学过程以及相关蛋白的功能有关，并且能够分别调整肾脏足细胞不同相关蛋白的表达，其机制可能与抑制足细胞的凋亡作用相关，但其具体作用机制还未明确[3]。为进一步探索苏木对膜性肾病的肾保护作用，本实验观察其对Heymann肾炎模型小鼠肾功能及足细胞自噬的影响，报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验药物 苏木购自黑龙江省药材公司，产地：云南。将苏木打粉过筛(40目)后使用75%乙醇浸泡，加热，连续回流提取，过滤；将2 次滤液合并，置于旋转蒸发器中水浴蒸干，转入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取干粉。将乙醇提取干粉加入双蒸水混悬，用乙酸乙酯萃取回收得到乙酸乙酯提取物。

1.2 实验动物 清洁级C57成年雌性健康小鼠25只，体质量为(17.2±3.2)g，购自黑龙江省中医药科学院动物实验中心，动物许可证编号：SYXK(黑)2016-008。实验期间动物室温度为 25～28 ℃，湿度为40%～70%，12 h交替照明，小鼠自由饮水，常规饲料喂养。

1.3 主要试剂及仪器 尿蛋白定量、白蛋白、血清肌酐测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；LC3Ⅱ Antibody、P62 Antibody、ATG5 Rabbit Polyclonal antibody：Proteintech Group；BCA蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物技术公司；C5b-9Rb、LC3ⅡRb：Abcam。mini protean 3 cell电泳仪：BIO-RAD 公司；PS-9电转仪：大连竞迈科技有限公司；MK3酶标仪：芬兰雷勃酶标仪；Pipetman移液器：吉尔森P型移液器；HI1210水浴锅：莱卡公司；Tanon-5200成像系统：Tanon公司；SQ2125石蜡切片机：莱卡医疗仪器有限公司；DS-Ri2显微图象分析系统、ECLIPSE Ni荧光显微镜：Nikon公司。

1.4 Heymann肾炎模型制备 从健康雄性C57小鼠体内提取FX1A抗原，免疫无菌兔体内获取兔抗血清，并且使用前在56 ℃的温度下灭活补体30 min。选择健康雌性C57小鼠，分2次腹腔注射兔抗FX1A抗原的血清，首次注射量2 mL，间隔1 h后注射1 mL。适应性饲养1周后将实验动物放入金属代谢笼内收集24 h尿液，使用考马斯亮蓝比色法测定24 h尿蛋白，24 h尿蛋白定量≥10 mg认为模型建立成功[4]。

1.5 实验动物分组及给药 将建模成功小鼠随机分成4组，每组5只，分别为Heymann肾炎模型组、低剂量苏木提取物组、中剂量苏木提取物组和高剂量苏木提取物组；另取正常小鼠5 只做正常对照。低、中、高剂量苏木组分别给予苏木提取物15、25、35 mg/(kg·d)灌胃，正常对照组和Heymann肾炎模型组则予相同体积的生理盐水灌胃；连续给药21 d。

1.6 观察指标

1.6.1 24 h尿蛋白定量及血清ALB、血SCr 在实验进行第21 天，末次给药后将小鼠置于代谢笼中留取24 h尿液，考马斯亮蓝比色法检测24 h尿蛋白定量；尿液留取结束后经腹主动脉采血，使用ELISA法检测血清白蛋白(ALB)及血肌酐(SCr)。

1.6.2 肾组织病理观察 处死小鼠取左肾经肾门冠状面切取肾组织1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，10%福尔马林固定48 h，洗涤脱水，浸蜡包埋，4 μm切片，HE染色,光镜观察。

1.6.3 肾组织 C5b-9沉积的免疫荧光染色检测 将制备好的肾脏组织切片烤片脱蜡，水化，抗原修复，分别用C5b-9抗体和LC3Ⅱ抗体荧光孵育，PBS冲洗后封片，-20 ℃冰箱保存，荧光显微镜拍片。

1.6.4 肾组织P62、Atg5、LC3II蛋白表达的Western blot检测 将组织剪成细小的碎片后加入裂解液，置于匀浆器中匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃ 12 000 g 离心15 min，取上清进行蛋白质定量检测后-80 ℃贮存。分别按照P62、Atg5、LC3II蛋白的分子量制备相关的PAGE胶。根据蛋白定量结果选取所需蛋白加入适量缓冲液，沸水水浴10 min后离心取上清上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免有余胶残留对上样产生影响。当染料到达胶底部时切停止电泳，进行下一步转膜。封面使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，按照说明书中的比例将抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育2 h。孵育一抗的膜使用TBST洗涤3次，每次5 min。随后根据用量，按照1∶1 000稀释HRP标记的二抗，与膜37 ℃孵育1 h后使用TBST洗涤3次，每次5 min。配制ECL发光液，根据用量取ECL发光液A和B等量混匀，加在膜的正面后暗室避光5 min。倒掉显色液后用纸小心吸取显色液，在上面盖上一层平整的透明纸，将其放入成像系统中进行扫描。

2 结果

2.1 各组小鼠24 h尿蛋白及血清ALB、SCr检测结果比较 见表1。

表1 各组小鼠24 h尿蛋白及血清ALB、SCr 检测结果比较

2.2 各组小鼠肾组织病理变化 HE染色可见：正常对照组小鼠的肾脏组织未见明显病理学改变。与正常对照组相比，模型组的肾组织明显分布不均匀，肾小球明显增大，系膜区增宽更为显著。苏木提取物各剂量组与正常对照组相比，部分组织排列较不规范，部分肾小球出现增大。见图1。

图1 各组小鼠肾组织病理变化(HE，×200)

2.3 各组小鼠肾组织C5b-9沉积的免疫荧光染色检测结果 Heymann肾炎小鼠肾组织可见C5b-9沿肾小球毛细血管袢呈弥漫、颗粒状沉积。与正常对照组比，模型组C5b-9的沉积明显增强；与模型组相比，苏木提取物各剂量组C5b-9的沉积明显减少。各给药组组间相比差异不大。见图2。

图2 各组小鼠肾组织C5b-9沉积的免疫荧光染色检测结果

2.4 各组小鼠肾组织P62、ATG5、LC3II蛋白表达的Western blot检测结果

与正常对照组相比，模型组P62表达明显降低，ATG5、LC3Ⅱ表达均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，各给药组P62表达明显升高，ATG5、LC3Ⅱ表达均明显降低(P<0.05)。苏木提取物各剂量组间相比较，高剂量组较低剂量组和中剂量组P62表达明显升高，ATG5、LC3Ⅱ表达均明显降低(P<0.05)，见图3。

3 讨论

目前认为膜性肾病是自身免疫抗体介导的疾病，其发病机制是由多种原因导致补体活化，继而形成C5b-9膜攻击复合物，从而引起足细胞损伤[5]。足细胞作为构成肾小球滤过膜的重要组成部分，其损伤和减少都可导致滤过膜损伤，从而导致蛋白尿的产生，是蛋白尿产生的重要环节[6]；蛋白尿又可以反向加重足细胞损伤，这一系列的病理改变导致肾小球进行性硬化，最终导致MN发展至肾功能衰竭[7]。苏木属豆科植物，《本草纲目》记载苏木可行血、破瘀。近年国内外学者研究发现苏木具有抗病毒、免疫抑制、抗肿瘤等作用。此外苏木能使心脏血管收缩增强，对中枢神经有催眠和麻醉作用，另外还具有抗流感、抗过敏和保护神经活动的作用[8-9]。本研究结果表明苏木提取物能有效减少Heymann肾炎小鼠尿蛋白，提高血清白蛋白，并保护肝肾功能。

A.正常组；B.模型组；C.苏木低剂量组；D.苏木中剂量组；E.苏木高剂量组注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与苏木低剂量组比较，▲P<0.05；与苏木中剂量组比较，#P<0.05图3 各组小鼠P62、ATG5、LC3II蛋白表达的Western Blot检测结果及灰度值比较

自噬是一种参与蛋白质和细胞器降解的细胞途径，在保持细胞稳态与人类疾病和生理学之间存在紧密的联系[10]。有研究结果显示自噬在肾小球衰老和肾小球疾病中起关键作用，并证实自噬是足细胞作为终末分化细胞维持结构和功能完整性的重要机制[11]；所以假设自噬可能是治疗肾小球疾病的新型治疗靶点具有合理性[12]。LC3是哺乳动物体内与酵母菌ATG8同源的基因，其编码蛋白是在高等真核细胞中发现的第1种自噬体膜蛋白，可以在监测自噬活动中作为自噬标志性分子[13]。LC3是控制自噬膜的形成和自噬体与溶酶体融合的关键蛋白，在自噬体膜的延伸和成熟中起关键性作用，其分为LC3 I和LC3Ⅱ，自噬发生时，可溶性LC3 I被活化，与磷脂以酰胺键进行结合形成LC3-PE，即膜结合形式的LC3Ⅱ[14]，从而促进自噬体的成熟，参与自噬体形成[15-16]。ATG5参与自噬体形成，在自噬体形成的早期阶段与ATG12形成复合物，复合物与自噬体外膜相结合，促进自噬体的伸展扩张的同时还促进自噬泡中LC3的募集[17-18]。当双层膜结构的自噬体即将形成环状闭合结构时，ATG5复合物便从膜上脱离，只留下LC3Ⅱ锚定在自噬体膜上[19]。因此，ATG5促进自噬体形成，而LC3Ⅱ含量与自噬体数量呈正比，是自噬体形成的标志[20]。细胞自噬受体蛋白P62作为泛素化底物和定位于自噬小体膜上LC3之间的连接因子可以被包裹进自噬小体降解。P62蛋白表达水平的高低与自噬活性成反比, 是检测自噬活性的一个辅助指标[21]。本实验研究结果显示，与正常对照组比较，模型组P62表达明显下调，ATG5、LC3Ⅱ表达均明显上调，说明造模后自噬增强；与模型组比较，苏木提取物各剂量组P62表达明显上调，ATG5、LC3Ⅱ表达均明显下调，说明原苏木提取物对自噬反应有抑制作用；其中高剂量组较低剂量组、中剂量组P62表达上调明显，ATG5、LC3Ⅱ表达均下调明显，说明高剂量时抑制效果最明显。

本实验研究结果显示苏木提取物对Heymann肾炎小鼠的足细胞具有保护和修复作用，可以减少小鼠24 h尿蛋白定量，升高血清白蛋白，降低肌酐水平；抑制细胞的自噬可能是苏木提取物发挥肾保护作用的机制之一，但其具体通过何种途径引起细胞自噬有待进一步研究证明。