基于PI3K/AKT/GSK-3β信号通路探讨益骨汤对去势大鼠骨质疏松的作用

李 宁，姚新苗，龚怡辰

(1浙江康复医疗中心，浙江中医药大学附属康复医院·浙江 杭州 310000；2浙江省中山医院·浙江 杭州 310000)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨微观结构破坏为特征，导致骨脆性增加，易于发生骨折的全身代谢性疾病。绝经后妇女及老年人为主要发病群体[1]。骨质疏松患者存在着骨生成与骨丢失的不平衡，这种不平衡与成骨细胞与破骨细胞的增殖、分化密切相关，成骨细胞及破骨细胞均来源于骨髓基质干细胞；因此骨髓基质干细胞向成骨细胞或者破骨细胞分化的信号通路是目前研究的重点，其中包括多种热门的信号通路，如Wnt/β-catenin信号通路、PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、RANKL/RANK/OPG信号通路等[2],本院姚新苗教授研发的益骨汤临床应用能明显改善OP患者的临床症状，降低骨折的发生率[3]。本研究通过Wistar大鼠切除卵巢复制OP模型，检测股骨骨组织中PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关基因及蛋白表达的变化，在细胞分子层面探究益骨汤防治OP的具体作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 12周龄健康清洁级雌性Wistar大鼠60只，体质量(195±10)g,Wistar大鼠均由浙江中医药大学动物试验中心提供，动物许可证号：SCXK(沪)2018-0034，实验室内温度在(22±2) ℃，湿度(50±8)%，光照与黑暗时间每12 h交替，自由饮水、摄食，所有实验动物以颗粒及水果混合饲料饲养，喂养10周后进行实验。

1.2 实验药物 益骨汤含淫羊藿、补骨脂、生地、丹参、山药及骨碎补6味中草药，均由浙江中医药大学附属中山医院中药房提供，煎药机配制成2 g·mL-1的提取液。戊酸雌二醇片：由拜耳医药保健有限公司提供。

1.3 试剂及仪器 血清BALP、OC和PINP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒：上海科顺生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及荧光定量试剂盒：杭州宝赛生物科技有限公司；DAB显色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司；总蛋白提取试剂盒：南京凯基生物有限公司；BCA蛋白定量试剂盒：天根生物科技有限公司。Agilent Stratagene Mx3005P定量PCR仪：美国安捷伦公司；Tanon GIS凝胶图像处理系统：上海天能科技有限公司；DPX-L型双能骨密度仪：美国Lunar公司。

2 实验方法

2.1 模型制备、分组及给药 按照数字随机表法将大鼠随机分为正常组、模型组、益骨汤组及戊酸雌二醇组，每组15只。腹腔注射水合氯醛麻醉后，模型组、益骨汤组及雌二醇组大鼠均切除双侧卵巢，建模成功率为100%，无大鼠死亡发生。正常组大鼠未做任何处理，各组大鼠均以饲料喂养12周，从第13周开始给药，正常组不做任何处理，模型组给予生理盐水10 mL·kg-1灌胃，益骨汤组以益骨汤提取液37.5 g/kg灌胃，雌二醇组按照0.36 mg/kg给予灌胃，均每天灌胃1 次,共喂养10周。

2.2 观察指标及测定

2.2.1 骨密度(BMD)检测 各组大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉成功后将各组大鼠固定于BMD测定台上，将大鼠拉直后双能骨密度仪测定每只大鼠脊柱的BMD。

2.2.2 血清BALP、OC和PINP含量检测 大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉成功后各组大鼠心脏采血，室温放置1～2 h并且3 500 r/min离心10 min后收集血清，用血清BALP、OC和PINP酶联免疫吸附试验(ELISA)、测定血清BALP、OC和PINP含量，具体操作步骤按照试剂盒说明要求进行。

2.2.3 PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关基因表达的实时荧光定量PCR检测 取2.2.2各组大鼠右侧股骨，剔除掉软组织，生理盐水冲洗后，放入液氮中，重复3次后放入-80 ℃中保存备用。Trizol一步法提取各组大鼠股骨骨组织中总RNA，荧光定量PCR按照试剂盒说明进行，以β-actin为内参，获得各组骨组织中PI3K、AKT、GSK-3β的相对表达量。

2.2.4 PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白表达的 Western blot检测 取2.2.2各组大鼠右股骨粉碎后，取骨组织1 g,加入含有RIPA的组织裂解液，同时加入蛋白酶抑制剂(PMSF),蛋白定量后放入沸水里约15 min,每个样品取50 μg进行十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶电泳，半干法转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脱脂奶粉封闭1 h，一抗在4 ℃下过夜，二抗在室温的情况下孵育1 h，加入ECL后曝光，使用图像处理系统扫描并计算每条带的吸光度值，将其与内参条带吸光度值的比值代表各组股骨骨组织中PI3K、AKT、P-AKt、GSK-3β的蛋白表达量。

2.3 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，多组计量资料比较采用单因素方差分析，方差齐性时，采用LSD法，方差不齐性时，采用Dunnettt′sT3法，P<0.05为具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠脊柱BMD及血清BALP、OC、PINP含量比较 结果见表1。

表1 各组大鼠脊柱BMD及血清BALP、OC、PINP含量的比较

3.2 各组大鼠骨组织PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关基因表达的比较 见表2。

表2 各组大鼠骨组织PI3K、AKT、GSK-3β mRNA 表达的比较

3.3 各组大鼠骨组织PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白表达的比较 见表3、图1。

表3 各组大鼠骨组织PI3K、AKT、GSK-3β蛋白 表达的比较

图1 各组大鼠PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达的Western blot检测结果

4 讨论

骨质疏松症(osteoporosis，OP)属于中医“骨痹”“骨痿”范畴，其发病机制与肾有关，多数观点认为，骨质疏松的发生与肾、脾、瘀关系密切[4]。肾虚是根本，脾胃虚弱是其发病的重要因素。中医理论认为,肾藏精,主骨,生精,为先天之本;脾主运化,为后天之本,是气血生化之源, 血瘀是病理产物，又属于致病因素，补肾健脾、活血化瘀是其主要的治疗原则。姚新苗教授一直致力于骨质疏松症的临床研究，通过中医经典理论，研发出经典方剂“益骨汤”，该方由补骨脂、骨碎补、怀山药、生地及丹参组成，方中以补骨脂、骨碎补补益肝肾、强壮筋骨为主；怀山药健脾，生地补肾益阴，丹参活血化瘀。临床研究发现，益骨汤能有效地提高老年骨质疏松患者的腰椎骨密度，减轻疼痛，抑制骨吸收，改善患者的临床症状[3]；动物实验表明，益骨汤能明显提高去势大鼠血清性激素水平，增强成骨细胞的活性[5]，提高大鼠的骨密度水平，进而提高大鼠的生物力学性能，并且可以通过降低大鼠血清炎性因子[6]的表达达到缓解疼痛等临床症状的效果。

骨重建过程主要由成骨细胞及破骨细胞共同参与完成[7]，骨质疏松的形成机制目前主要是骨重建负平衡导致，骨重建过程中骨吸收大于骨形成造成了骨质疏松[8]。成骨细胞及破骨细胞共同起源予骨髓基质干细胞(BMSCs)，因此，通过诱导BMSCs向成骨细胞转化成为了现在研究的重点[9]。目前研究表明，多种信号通路可影响BMSCs向成骨细胞转化，如经典的Wnt/β-catenin 信号通路[10]、TGF-β/BMP-2 信号通路[11]及PI3K/AKT/GSK-3β信号通路等。前期实验研究表明，益骨汤可以通过经典Wnt 两条信号通路，通过调节Wnt、BMP2、β-catenin、Runx2、OSX等因子[12]实现诱导成骨细胞增殖分化，促进骨形成，防治骨质疏松[13-15]。除Wnt/β-catenin信号通路外，PI3K/AKT/GSK-3β信号通路一直以来都是研究细胞增殖与凋亡的重点[16]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，由各种催化亚基组成，细胞外信号和活化的Ras蛋白质受体相结合，激活PI3K,PI3K磷酸化PIP2,使PIP2转换成PIP3,PIP3与AKT的PH结构相结合，使AKT募集到细胞膜上，使AKT 的第 308 位酶氨酸磷酸化[17]，从而激活AKT(p-AKt)，GSK-3β是其该信号通路的下游因子，是被发现的 AKT 作用的底物， AKT 可使 GSK-3β第9位丝氨酸磷酸化，降低 GSK-3β的磷酸化水平，增强碱性磷酸酶(ALP)活性、促进Ca2+沉积和上调OCN、Runx2的表达水平，促进成骨细胞的增殖，从而发挥细胞增殖和分化的调控作用。

本研究结果表明，益骨汤组及雌二醇组均能提高去势大鼠脊柱BMD，与模型组相比具有明显差异性(P<0.05)，模型组血清BALP、OC和PINP的含量较正常组明显降低(P<0.05)，益骨汤组及雌二醇组血清BALP、OC和PINP的含量较模型组明显升高(P<0.05)，益骨汤组及雌二醇组均能提高去势大鼠PI3K的基因及蛋白表达水平及P-AKt蛋白的表达水平并降低 GSK-3β基因及蛋白的表达水平，与模型组相比具有明显差异性(P<0.05)，与正常组相比无明显差异性(P>0.05)，两组对AKT基因及蛋白的表达水平较正常组及模型组无明显差异(P>0.05)。表明益骨汤可以增强去势大鼠骨密度，可能是通过调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路实现的。