水蛭对局灶节段性肾小球硬化大鼠肾组织转化生长因子和I型胶原表达的影响

张依轮，刘 娜，王立范，杨 馨，安 艳，李 倩，罗文佳

(1黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036；2怀远县中医院·安徽 怀远 233400；3苏州工业园区金鸡湖社区卫生服务中心·江苏 苏州 215000)

局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)是原发性肾小球疾病的一个较为常见的病理综合征，以大量蛋白尿或肾病综合征为主要临床表现，以局灶节段性分布的肾小球硬化为主要病理特征，是导致终末期肾脏病的主要原因之一[1]。细胞外基质(ECM)由胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖5类物质组成，ECM的过度积聚是导致肾小球硬化的重要因素，在FSGS进展的过程中扮演着着十分重要的角色[2]。

中药在防治慢性肾脏病的过程中始终发挥着重要作用，其中水蛭性味咸苦平，入肾、膀胱经，逐瘀通经，破血而不伤新血，可以有效延缓慢性肾脏病进展并缓解肾脏病患者高凝、易栓状态。据现代药理学研究表明：水蛭含水蛭素、氨基酸、微量元素等成分，具有良好的抗凝、抗炎、抗细胞凋亡、抗纤维化、抗血栓以及抗肿瘤等作用[3]，不仅在防治心脑血管系统疾病、肿瘤、甲状腺疾病以及骨伤科疾病中应用广泛[4]，还可以有效的治疗慢性肾脏病。近年来，在中医久病入络理论和现代药理学研究的佐证下，水蛭逐渐成为治疗难治性慢性肾脏病的优选药物。且已有实验证实水蛭能通过减轻ECM的积聚来延缓FSGS的发展进程[5]。本研究拟观察水蛭对FSGS大鼠TGF-β1及I型胶原表达的影响，探讨其在ECM积聚以及FSGS病情进展过程中的作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料及方法

1.1 实验动物 健康成年雄性Wistar大鼠共52只，购自于长春亿斯实验动物技术有限责任公司，体质量：180～220 g，实验动物证号：SCXK-(吉)2016-0001，微生物控制等级：SPF 级。

1.2 实验药物 水蛭颗粒剂：由江阴天江药业有限公司生产，批号：1212081，规格：0.5 g/袋(有效成分与饮片3g等量)。

1.3 试剂与仪器 阿霉素：浙江海正药业有限公司； I型胶原兔抗大鼠多克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司；TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗体：北京博奥森生物技术有限公司；兔抗鼠二抗PV6001：由北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。电子天平：由上海方瑞仪器有限公司；台式低速离心机：德国Eppendorf公司；超低温冰箱：SANYO ULTRA LOW Japan；Motic3000显微摄影系统：美国麦克奥迪实业集团有限公司；2135型切片机：德国莱卡。

2 方法

2.1 动物模型制备、分组与给药 52只Wistar大鼠进入实验室适应性饲养l 周，实验前先将大鼠置于代谢笼中留取尿液标本，用尿蛋白试纸测定尿蛋白呈阴性后随机分成3组：即正常组12 只、假手术组12 只和造模组28 只。造模[5]：10%水合氯醛麻醉大鼠并固定于操作台上，肾区皮肤常规消毒，沿脊柱左侧旁做一纵行切口，切开皮肤后逐层向深处分离对肾脏进行充分的游离暴露，将大鼠肾脏拉到手术切口外，分离肾门处的脂肪组织使肾动静脉充分显露，取动脉夹钳夹动静脉，结扎后切除左肾，结扎确定无出血后，缝合切口并消毒，清理体表血迹以防后期饲养撕咬。术后第1～3天，青霉素4万U/d腹腔注射。肾摘除术后第7天，阿霉素(4 mg/kg)尾静脉注射。术后第14天，将成模28 只大鼠随机均分为模型组和水蛭组，术后第35天，造模大鼠尾静脉注射阿霉素(3 mg/kg)。假手术组大鼠经10%水合氯醛麻醉后，仅作脊柱旁纵行切口并剥离左肾的脂肪包膜，不行左肾摘除术，术后第14天，予等剂量生理盐水经尾静脉进行注射，术后第35天，再次进行生理盐水经尾静脉注射。正常组大鼠不作任何处理，正常进行饲养。水蛭组于左肾摘除术后第14天开始，以水蛭[0.9 g/(kg·d)]进行灌胃给药，其余各组以等容积蒸馏水进行灌胃，共灌胃8周。

2.2 观察指标

2.2.1 一般状态

2.2.2 肾组织TGF-β1、I型胶原表达的免疫组化检测 灌胃第4周、第8 周末，每组各随机选出6只大鼠处死以进行取材。将大鼠处死后立即进行右肾摘除术，随后切除大鼠肾脏的部分肾皮质用于免疫组化检验。将肾皮质进行固定(使用10%甲醛溶液)，采用PV二步法对肾组织I型胶原、TGF-β1蛋白表达进行检测。 切片常规脱蜡和水化后于3%H2O2中孵育10 min，以PBS冲洗3 次，每次冲洗2 min；随后进行微波炉抗原修复：705-800W，95 ℃中央加热2 次，每次加热5 min；而后分别滴加工作浓度的第一、二抗体，并分别在湿盒内进行孵育30～60 min，DAB显色5～10 min后用蒸馏水充分冲洗后以苏木素淡染细胞核，常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察。用Motic3000显微摄影系统于400倍下摄片，采用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达进行定量分析，以积分光密度(IOD)代表蛋白相对表达量。积分光密度(IOD)=阳性面积×平均光密度，每组随机分析6个高倍镜视野，取其均值代表该照片的相对表达量。染色结果细胞核呈蓝色，阳性为黄色或黄棕色。

3 结果

3.1 各组大鼠一般状态 实验过程中，模型组1只大鼠在尾静脉进行阿霉素注射后死亡。正常组、假手术组食量正常，皮毛光滑润泽，活动状态正常，精神良好，体质量在正常范围内有所增长；模型组食量均减少，皮毛晦暗干枯无光泽，呆滞不喜动，体质量有所减轻甚至低于正常体质量范围。与模型组比较，治疗组皮毛光滑度稍佳，精神状态及灵敏度稍佳，体质量降低速度较慢。

3.2 各组大鼠肾组织TGF-β1免疫组化检测结果 见表1，图1。

表1 各组大鼠肾组织TGF-β1表达的比较

图1 各组大鼠肾组织TGF-β1表达的免疫组化检测(×400)

TGF-β1在肾组织中的表达主要集中在肾小球系膜区，阳性表达表现为黄褐色颗粒状沉积，着色较深。各时间点，假手术组与正常组TGF-β1表达均较弱；模型组TGF-β1表达与正常组相较明显增强,差异具有极显著统计学意义(P<0.01)；水蛭组TGF-β1表达较之模型组均减弱，差异具有极显著统计学意义(P<0.01)。

3.3 各组大鼠肾组织I型胶原表达的免疫组化检测结果 I型胶原在肾小球内皮细胞、系膜细胞和上皮细胞上均有表达，阳性表达表现为黄褐色颗粒状沉积，着色较深。假手术组与正常组I型胶原表达均较弱；模型组I型胶原表达较正常组明显增强,差异具有统计学意义(P<0.01)；水蛭组I型胶原表达较之模型组表达明显减弱，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2，图2。

图2 各组大鼠肾组织I型胶原表达免疫组化检测(×400)

表2 各组大鼠肾组织I型胶原表达的比较

4 讨论

局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)的发生发展与多种因素有关，而其重要的病理改变表现为ECM

的过度积聚，因此，抑制ECM的过度积聚为延缓FSGS病程进展的关键一环[6]。TGF-β1作为ECM积聚的重要因素，具体表现在以下几个方面：(1)TGF-β1可以通过刺激成纤维细胞、肾小球细胞等促进ECM合成。(2)TGF-β1通过抑制多种ECM降解酶的活性及刺激基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)和纤溶酶原激活物抑制剂的活性增加抑制ECM降解。(3)TGF-β1通过加强ECM受体如整联蛋白的表达来增加细胞与ECM之间的相互作用[7]。I型胶原是ECM的重要组成成分，其蛋白的表达主要是通过各种生长因子以及细胞因子进行调控，其中转化生长因子-β扮演着尤为重要的角色。在病理情况下，I型胶原调节路径的改变会刺激胶原过度生成[8]；已有实验证实I型胶原的合成、分泌增多和降解减少亦是ECM积聚及肾间质纤维化的重要原因[9]。因此TGF-β1及I型胶原表达的调节在ECM积聚的过程中扮演了十分重要的角色。

ECM的过度积聚使毛细血管袢逐渐闭塞狭窄，加重肾小球硬化，最终促成FSGS这一难治性肾病的发生发展，此病理特点与中医痰湿瘀毒郁滞肾络而致癥瘕的病机特点十分契合，符合中医“肾络郁滞”“久病入络”的理念，治疗当以活血化瘀通络为主。而应用普通的活血化瘀药物往往很难取得良好的效果，唯有应用“搜剔络邪”之虫类药才能奏以奇效[10],且FSGS病程长而致正气多有耗损，不可使用过于峻猛之药损伤正气，故选用水蛭最为恰当。水蛭，俗称蚂蟥，性味咸苦平，入肾、膀胱经，具有破血逐瘀通经的功效。张锡纯评价此药“破瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分丝毫无损，而血瘀默然于无形，真良药也”[11]，国医大师张琪教授在辨治FSGS时方中加入水蛭常奏以良效。现代药理学研究表明，水蛭有抗凝、抑制血小板聚集、促纤溶、扩血管、促进血液循环、抗炎等作用，经实验证实对于肾脏可以起到很好的保护作用[12]。本文实验研究结果证实：水蛭可能通过调节FSGS模型大鼠肾组织TGF-β1及I型胶原的表达来减轻ECM的积聚，从而延缓FSGS的进展。