柞蚕雄蛾浓缩液改善高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝

朱琳，郭光，范作卿，王娜，施新琴，吴建军

（1.山东省蚕业研究所，山东 烟台 264002；2.宁阳县农业农村局，山东 宁阳 271400）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精外的其他因素导致的肝脏弥漫性脂肪浸润。随着经济水平的提高及人们生活方式的改变，NAFLD的发病率逐渐增高，引起社会广泛关注。已有诸多研究表明，脂肪性肝炎可进展为肝纤维化、肝硬化并可能最终形成肝衰竭，同时NAFLD还会促进胰岛素抵抗、糖尿病、病毒性肝炎、代谢性综合征和动脉粥样硬化等疾病的发生与发展［1］。目前国内外学者大多认同NAFLD的发病机理为“二次打击”理论。其中，“首次打击”为高脂饮食影响脂质代谢，游离脂肪酸（FFA）不断增多，导致肝脏线粒体氧化超载，同时高胰岛素又使得糖酵解增加促进脂肪酸的合成，最终导致甘油三酯（TG）在肝脏中堆积，引起呈良性的肝内脂肪堆积（单纯性脂肪肝）。“第二次打击”主要是在此基础上发生的氧化应激和炎症细胞因子的异常。丙二醛（MDA）、4－羟基壬酸等脂质过氧化物增多，结果促进肝细胞酶的活性并抑制线粒体的功能；库普弗（Kupffer）细胞激活，细胞因子比如TNF－α、IL－6等的参与，导致肝星状细胞激活、增殖，进而导致肝脏炎症，炎症持续存在并造成肝细胞坏死形成进展性肝纤维化，并最终导致肝硬化和肝癌［2］。其他如激素、环境、遗传、免疫反应、持续轻微的内毒素血症、缺氧和肝微循环障碍等也参与了此病的形成，说明其有多环节、多因素的发病特点。

柞蚕蛾（Antheraea pernyiGuerrin-Meneville）属于节肢动物门昆虫纲鳞翅目天蚕蛾科柞蚕属，是一种在我国具有悠久养殖历史的药食两用经济昆虫，属完全变态昆虫。柞蚕雄蛾历史上曾作为贡品，有“神虫国宝”之美誉，其功效在《本草纲目》早有记载：“雄原蚕蛾益精气，强阴道，交接不倦，亦壮阳事，止泄精、尿血、暖水脏，治暴风、金疮、冻疮、汤火疮，灭瘢痕”［3］。柞蚕雄蛾营养物质丰富，干物质中含粗蛋白40.49%且氨基酸种类齐全、比例适当，高于世界卫生组织和联合国粮农组织（WHO／FAO）推荐的蛋白质氨基酸记分模式；脂肪酸含量中不饱和脂肪酸占78.6%，必需脂肪酸占43.0%，超过了《食物成分表》中任何一种动物的脂肪酸含量；还含有丰富的矿物质、微量元素、维生素和激素等其他活性物质［4］。我国柞蚕资源丰富，近年来对柞蚕雄蛾的综合加工利用已引起人们的高度重视，现已开发出一些食品、保健品和医药品，取得较大的经济效益和社会效益。为了确保柞蚕雄蛾的食用及药用安全性，有研究以昆明小鼠为实验动物，检测柞蚕雄蛾粉的急性毒性和致突变性，结果表明其对昆明小鼠无急性毒性、无致突变性和无致畸性［5］。柞蚕雄蛾浓缩液是本研究团队选用初羽化、未交尾的柞蚕雄蛾为原料，经乙醇浸泡后低温减压抽提得到的具有生物活性的保健产品［6］，对其部分营养成分及食品卫生指标的测定结果表明：18种游离氨基酸总量为11.34 g／L，其中人体必需氨基酸含量达3.29 g／L，占总量的29%；脂肪含量为0.09%；维生素A、E、B1、B2及8种矿质元素含量也很丰富［7］；通过紫外分光光度法初步确定其中含有一些激素类成分如睾丸酮和蜕皮激素［8，9］。

目前国内外对柞蚕雄蛾产品的功能成分、功效及其作用机理的研究甚少，并且大部分研究还停留在表面。柞蚕雄蛾浓缩液对NAFLD的作用研究也尚未见报道。因此，本团队基于以前的研究基础，通过小鼠试验，研究柞蚕雄蛾浓缩液对高脂诱导的小鼠NAFLD的防治作用，以期为柞蚕的综合开发利用提供理论依据，并为开发预防和治疗NAFLD的产品做探索性研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

柞蚕雄蛾浓缩液，由山东省蚕业研究所2019年提取制备；雄性C57BL／6J小鼠，每只18～20 g，购自济南金丰实验动物有限公司；辛伐他汀购自Sigma公司；四氯化碳（CCl4）、无水乙醇、甲醛等试剂均购自生工生物工程（上海）有限公司。

H2200R冷冻离心机，购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；HM325轮转式切片机，购自赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；博视达拍照显微镜，购自深圳市博视达光学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物实验 先将小鼠随机分为2组，其中空白对照组（A组）5只，饲喂正常饲料；造模组33只，饲喂高脂饲料并注射5% CCl4，剂量为0.01 mL／g，每周两次。三周后，挑选3只模型组小鼠，取肝脏做组织切片，HE染色，根据肝脏病变情况判断是否造模成功。

造模成功后，将造模组小鼠重新分配，随机分为3组，每组10只，B组为模型组，C组为柞蚕雄蛾浓缩液处理组，D组为阳性对照组。A、B两组灌胃生理盐水，C组灌胃0.8 g／mL柞蚕雄蛾浓缩液，D组灌胃2 mg／mL辛伐他汀溶液，灌胃剂量为0.01 mL／g，每日灌胃1次，连续30 d。每隔3天测量一次小鼠体重，绘制体重曲线。试验结束前小鼠禁食禁水8 h以上，之后摘眼球取血，然后断颈处死，解剖取肝脏和脂肪组织并对其进行称重，计算器体比。器体比又称脏器系数，是实验动物某脏器的重量与其体重之比。

1.2.2 血脂四项的测定 血浆静置1 h后，4 000 r／min离心5 min，取血清，检测血脂四项，即总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL－C）和低密度脂蛋白（LDL－C）。

1.2.3 组织学分析 摘取肝脏和脂肪组织，以纯净水洗去血污，4%福尔马林固定，HE（苏木精－伊红）染色，石蜡包埋切片，在显微镜下进行病理组织学观察、拍照，分析肝脏炎症及损伤情况。

1.3 数据分析

每组数据至少3个重复，所有数据处理及方差分析均采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 柞蚕雄蛾浓缩液对小鼠体重增长的影响

柞蚕雄蛾浓缩液处理组与阳性对照组小鼠的体重差异较小，变化趋势基本一致，但均显著低于模型组和空白对照组；模型组小鼠的体重在处理前9天内低于空白对照组，但9天后明显高于空白对照组（图1）。

图1 小鼠体重变化曲线

2.2 柞蚕雄蛾浓缩液对小鼠肝脏及脂肪组织增长的影响

由图2可见，柞蚕雄蛾浓缩液处理组的肝脏质量／体重值为0.032，低于其它处理组，但处理间差异不显著；浓缩液处理组的脂肪质量／体重值为0.014，略高于空白对照组，但低于阳性对照组和模型组，且与模型组（0.027）差异极显著（P＜0.01）。

图2 小鼠肝脏（a）和脂肪（b）器体比

2.3 柞蚕雄蛾浓缩液对小鼠血清中血脂四项的影响

由图3可见，柞蚕雄蛾浓缩液处理组的TC水平最低，显著低于模型组和阳性对照组（P＜0.05），与空白对照组差异不显著。柞蚕雄蛾浓缩液处理组的TG水平低于模型组和阳性对照组，但差异不显著；三者TG水平均显著高于空白对照组。在HDL－C水平上，柞蚕雄蛾浓溶液处理组最低，其次为阳性对照组、模型组、空白对照组，但四组处理间差异不显著。柞蚕雄蛾浓溶液处理组的LDL－C水平最低，与空白对照组差异不显著，但显著低于模型组和阳性对照组。

图3 小鼠血脂四项测定结果比较

2.4 柞蚕雄蛾浓缩液对小鼠肝脏及脂肪组织的病理学影响

如图4所示，空白对照组小鼠肝脏细胞排列紧密，细胞形态完整，无脂肪滴，无炎症反应；模型组小鼠肝脏细胞排列松散无序，部分细胞核破损，多处出现脂肪颗粒；柞蚕雄蛾浓缩液处理组细胞排列有序，形态完整，无脂肪滴，无炎症反应；阳性对照组细胞排列有序，形态完整，无脂肪滴，少数细胞出现空泡现象。

图4 肝脏HE染色（400×）

如图5所示，模型组脂肪细胞明显大于其它三组；柞蚕雄蛾浓缩液处理组和阳性对照组的脂肪细胞直径相差不多，但比空白对照组稍大。

图5 脂肪HE染色（400×）

3 讨论与结论

本团队前期对柞蚕雄蛾浓缩液的保健功能做了初步研究，表明其可明显降低四氯化碳中毒小鼠的肝细胞变性、坏死程度和范围，对受损肝组织具有明显保护作用，对于高脂血症有良好的治疗效果［10］；Li等［11］研究证明柞蚕雄蛾浓缩液的有效成分对小鼠细胞免疫和体液免疫均具有明显增强作用，对单核吞噬细胞系统功能也有一定增高趋势，并且还具有一定的抗肿瘤作用［12］。此外，柞蚕雄蛾浓缩液对酒精性脂肪肝也被证明有一定的预防作用，能抵抗因饮用酒精而导致的肝细胞线粒体脂质过氧化，对乙醇诱导的肝脂肪变性有一定保护作用［13］；贾青等进一步探明柞蚕雄蛾浓缩液能够降低小鼠早期酒精性肝病Kupffer细胞Toll样受体4及肝组织中TNF－α的表达［14］。另外，柞蚕雄蛾浓缩液对酒精诱导的小鼠肝纤维化也具有显著的预防作用，其机制可能与调控TGFβ1／Smad2／3信号转导通路、下调TIMP及抑制CTGF的活化与增殖有关［15］。

本研究结果表明，其能够降低高脂诱导的NAFLD小鼠体重、肝脏质量／体重和脂肪质量／体重的值，说明其能够减少小鼠体内的脂肪堆积。HE染色结果表明，其能够明显减少肝脏炎症反应和脂肪化及改善脂肪在体内的堆积。本研究结果可为利用柞蚕开发预防和治疗NAFLD的产品提供参考。