牛流行热病毒山东分离株α3基因序列分析及原核表达与纯化

朱鸿超，何畅，侯佩莉，王洪梅，李雪漫，唐文娟，何洪彬

（1.山东师范大学生命科学学院／反刍动物疾病研究中心，山东 济南 250014；2.山东师范大学附属中学国际部，山东 济南 250014）

牛流行热病（bovine ephemeral fever，BEF）是一种通过空气、同槽、节肢动物（主要是蚊子）引起动物牛（黄牛、水牛和乳牛）的急性热性传染病［1－3］，其特征为突然高烧，呼吸道、消化道严重的卡他性炎症以及运动障碍。该病多发生在6—9月份，流行面广、传播速度快、病势猛，尤其是高温多雨时发病率极高，短期内可使任何品种、性别、年龄的大批牛只黏膜化脓、奶量降低、瘫痪以及死亡，具有发病率、死亡率高等特点，给养牛业造成巨大的经济损失。目前在亚洲（中国的28个省）、非洲和大洋洲的40多个国家发现有BEF的广泛流行传播，防控牛流行热病已成为中国畜牧业的重中之重［4］。

牛流行热病病原为牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）［5］。该病毒为弹状病毒科、牛流行热病毒属的单股负链RNA病毒，只有一个血清型，病毒粒子主要存在于病牛呼吸道分泌物、血液及粪便中。该病毒基因组大小约为14.9 Kb，编码5个典型的弹状病毒结构蛋白（N、P、M、G和L）和6个非结构蛋白（Gns、α1、α2、α3、β和γ）［6，7］。其中α3蛋白是牛流行热病毒基因组编码的一个非结构蛋白，其功能报道较少［8］。

目前尚未有牛流行热病商品化诊断试剂盒，已上市批准的牛流行热病毒疫苗种类较少且单一［9－13］。因此本研究旨在通过生物信息学分析α3蛋白相关特征，构建pGEX－4T－1－α3原核表达载体，表达并纯化此蛋白，为进一步制备α3多克隆抗体、建立相关的血清学检测方法、研制高效准确的诊断试剂和新型疫苗等提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病毒RNA提取试剂盒购自成都福际生物技术有限公司；反转录试剂盒购自Thermo Fisher；BEFV山东分离株、pGEX－4T－1载体为本实验室保存；2×Phata max master mix、胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；rTaq聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司；Ex taq聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ／XhoⅠ、DNA Marker购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α感受态、大肠杆菌BL21感受态购自北京全式金生物技术有限公司；氨苄青霉素、IPTG诱导剂、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、咪唑、0.45 μm PVDV膜、5×SDS上样缓冲液为Solarbio公司产品；电泳液（5×）、转膜液（10×）、TBST（10×）购自上海雅酶生物科技有限公司；GST抗体购自Abways公司。

1.2 试验方法

1.2.1 BEFVα3基因的扩增 根据BEFV山东分离株α3的基因序列，利用Primer 5.0软件进行引物设计（表1）。引物由青岛擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

按试剂说明书提取BEFV的全基因组并反转录成cDNA，以其为模板采用PCR扩增α3基因片段。反应体系（50μL）：18μL ddH2O，3μL cDNA模板，25μL 2×Phata max master mix，2μL（10 μmol／L）上游引物，2μL（10μmol／L）下游引物。扩增条件：95℃3 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，共35个循环；72℃5 min。将符合预期的琼脂糖凝胶电泳条带进行回收［14］。回收产物连接pEASY－T载体，挑取单克隆菌落，送青岛擎科生物技术有限公司测序。

1.2.2 α3序列同源性分析 从GenBank中查找到3株来自中国和1株来自泰国的BEFVα3参考序列（表2）。使用DNAStar中的MegAlign将BEFV山东分离株α3基因与参考毒株信息进行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比对分析［15］。

表2 参考毒株信息

1.2.3 生物信息学分析 测序获得牛流行热病毒山东分离株α3蛋白完整的基因序列，利用ProtParam 软件和抗原表位分析软件（Immune Epitope Database Analysis Resource，http：／／tools.immuneepitope.org／bcell／）中 的Bepipred Linear Epitope方法预测氨基酸水平的B细胞线性表位及亲水性关系，以确定α3蛋白是否为亲水性的可溶性蛋白［16］。

1.2.4 原核表达载体pGEX－4T－1－α3的构建采用BamHⅠ／XhoⅠ分别双酶切pGEX－4T－1载体和α3基因序列。酶切目的基因α3的体系为：BamHⅠ3μL，XhoⅠ3μL，10×Fast Green Buffer 5μL，胶回收后的α3基因39μL，37℃；酶切载体的体系为：BamHⅠ3μL，XhoⅠ3μL，10×Fast Green Buffer 5μL，pGEX－4T－1载体4 μL，ddH2O 35μL，37℃。采用2%的琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定。用T4 DNA连接酶将α3基因序列与pGEX－4T－1载体连接。连接体系为：T4 DNA ligase 0.8μL，5×T4 DNA ligase Buffer 2 μL，pGEX－4T－1载体2μL，α3基因4μL，ddH2O 1.2μL，25℃连接15 min。将连接的重组质粒pGEX－4T－1－α3转化DH5α，而后在有氨苄抗性的LB固体培养基上涂板，待长出菌落后挑取单克隆放入含有氨苄的LB液体培养基中，37℃摇床培养8 h后交由擎科生物科技有限公司测序，测序正确的克隆提取质粒－20℃保存备用。

1.2.5 α3重组蛋白的诱导表达及产物纯化 将测序正确的重组质粒pGEX－4T－1－α3转化至大肠杆菌BL21感受态，接种到含有氨苄固体LB培养基上，长出菌落后挑取单克隆菌落到液体LB培养基中，振荡培养12～14 h后保存菌液。取pGEX－4T－1－α3重组菌液2 mL加入到200 mL液体LB培养基中，37℃、200 r／min振荡培养至菌液OD600值为0.4～0.6时，加入200μL IPTG诱导4 h，同时设置空载体pGEX－4T－1作为对照。菌液离心后将沉淀的菌体用NPI－10重悬，随后进行超声破碎（350 W，工作5 s，停止5 s，超声破碎1 h），12 000 r／min离心10 min，取出上清加入GST磁珠，在旋转摇床上结合过夜，用NPI－20冲洗结合蛋白的GST磁珠5次，每次5 min，将洗杂完的磁珠转入纯化柱中，分装3个1 mL的离心管收集α3蛋白。将菌液超声后的上清、纯化的α3融合GST、GST空载的菌液超声后的上清和纯化的GST磁珠进行SDS－PAGE电泳（150 V，1 h），电泳结束后加入10 mL的考马斯亮蓝染液，放入孵育摇床上4 h后观察蛋白表达情况。

1.2.6 Western Blot鉴定α3重组蛋白 通过Bio－Rad湿转电泳仪（220 mA，160 min）冰浴条件下将空载体表达GST纯化蛋白和α3融合GST纯化蛋白进行SDS－PAGE电泳，胶分离后将其转移到PVDF膜上。转膜后放入10 mL含5%脱脂奶粉溶液中，室温条件下封闭2 h后弃去封闭液，重新加入GST的单克隆抗体血清，室温孵育2 h后弃去一抗，用PBST洗涤3次，每次5 min，然后加入1∶2 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，再用PBST洗涤3次，每次5 min。最后滴加ECL发光液进行显色，并用化学发光检测仪进行观察。

2 结果与分析

2.1 α3基因的PCR扩增

以BEFV的cDNA为模板，采用特异性引物α3－F和α3－R进行PCR扩增，结果如图1所示，扩增条带156 bp，与预期的α3基因大小一致。连接T载体后进行基因测序，序列与参考基因的序列一致。

图1 RT－PCR扩增α3基因片段电泳图

2.2 α3序列的同源性分析

测序比对结果表明，从山东分离株上克隆的α3基因片段长度为156 bp，编码51个氨基酸。该基因核苷酸序列与参考毒株的同源性为98.0%～100.0%，氨基酸的同源性也为98.0%～100.0%（表3）。表明α3蛋白具有较高的保守性。

表3 BEFV山东分离株与参考毒株的α3序列同源性分析（%）

2.3 α3蛋白结构和功能分析

根据ProtParam软件预测，α3蛋白的理论等电点为9.23，不稳定系数为48.73，总平均疏水性为－0.737，说明α3是一个可溶性蛋白。

根据蛋白抗原表位分析α3蛋白B细胞线性表位结果表明，α3蛋白包含5个线性表位，其中区段3～5 aa、9～47 aa是α3蛋白的优势抗原表位区段（图2）。明确α3蛋白的线性表位区段，为获得特异性的抗原区段提供了较好的依据。

图2 α3蛋白的B细胞线性表位分析

2.4 重组质粒构建及鉴定

将扩增目的片段和pGEX－4T－1载体用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接转化后构建pGEX－4T－1－α3重组载体，重组载体用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切（图3），得到α3目的片段和pGEX－4T－1的线性片段且基因片段大小与预期相符。基因测序分析表明插入目的基因正确，说明成功构建了重组表达质粒pGEX－4T－1－α3。

图3 pGEX－4T－1－α3重组载体双酶切鉴定

2.5 融合α3蛋白的表达纯化及鉴定

蛋白表达结果（图4）显示，通过泳道1和泳道2对比，说明α3蛋白正常表达，泳道3和泳道4说明GST空载正确表达，泳道1和泳道4说明GST及α3融合GST纯化效果好，与预期相符。

图4 重组α3蛋白表达和纯化检测

2.6 α3融合蛋白Western Blot鉴定

Western Blot鉴定结果（图5）显示，纯化后的α3和GST融合蛋白、GST蛋白能够与GST的抗体在大约30 kDa处发生特异性反应，与预期大小一致，表明α3目的蛋白表达正确。

图5 纯化后的α3蛋白Western Blot检测

3 讨论与结论

BEFV与狂犬病毒、水泡性口炎病毒均属于弹状病毒科［17］。但BEFV在基因组大小及编码蛋白上存在较大差异，除了5个结构蛋白外，还编码6个非结构蛋白，这些非结构蛋白是BEFV所特有，关于其功能研究报道较少［18－22］。本研究表明，山东分离毒株牛流行热病毒α3基因片段大小为156 bp，编码51个氨基酸，与参考毒株的核苷酸序列及氨基酸序列同源性均大于98.0%，因此推测α3蛋白在不同毒株之间具有很高的保守性。牛流行热病毒实验室诊断方法主要为核酸检测与血清学检测，应用的靶蛋白主要是病毒的G糖蛋白，但是G糖蛋白容易发生突变，从而导致检测的特异性低。鉴于α3蛋白具有一定的保守性，可能是BEFV血清学诊断的重要抗原［5，23］。

本研究首先通过生物信息学软件对α3蛋白的抗原表位进行分析，结果表明，α3蛋白包含5个B细胞线性表位，其中区段3～5、9～47 aa是α3蛋白的优势抗原表位区段，推测α3蛋白可能具有免疫原性。赵庆亮等［16］利用ProtParam软件分析蛋白的亲水性，以判断该蛋白是以包涵体形式存在还是可溶性形式存在。本研究根据Prot-Param软件预测α3蛋白的总平均疏水性为－0.737，推测其为可溶性蛋白。本试验成功构建了pGEX－4T－1－α3重组载体，将其转化BL21感受态中，IPTG诱导4 h后，α3蛋白能够高效以可溶性蛋白表达，进一步通过GST磁珠纯化获得较高浓度的α3蛋白，这提示BEFV的α3蛋白可能是一个重要潜在亚单位疫苗的候选蛋白，需要进一步进行免疫原性的研究［24－28］。纯化的α3融合GST蛋白与磁珠可作为GST pull－down试验的诱饵蛋白，免疫沉淀BEFV感染的宿主细胞蛋白，可为研究α3蛋白的相关功能奠定基础。

综上所述，本研究利用原核表达系统将α3蛋白与GST融合可溶表达，纯化具有天然免疫构像活性且产量高的蛋白，具有极大的商品化潜力，为下一步诊断方法的创新、寻找与α3相互作用的蛋白及研制新型的BEFV疫苗提供了理论基础。