药用植物内生菌资源在农业中的应用与研究进展

常恺莉，张琳，周红英，张晨雪，叶鸿翔，梅显贵

（山东农业大学农学院，山东 泰安 271018）

随着微生物研究的不断发展，人们在健康植物组织内部也发现微生物的存在，这类微生物后来被称为“植物内生菌”。目前从藻类、苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物中均已分离到内生菌，并且具有丰富的生物多样性［1－4］。19世纪中叶，De Bary首先提出了内生菌（endophyte）的概念，将生活在植物组织内部的微生物与生长在植物表面的表生菌（epiphyte）相区别［5］。1991年Pertrini［1］定义内生菌为“一类在其生活史中的某一段时期存在于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物”。

诸多研究表明，内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中逐渐形成了一种互利互惠的关系，并塑造了内生菌特有的基因特征和代谢产物，既能够直接促进植物生长如调节或合成植物生长激素、调节根部生理、促进营养吸收［6，7］等，通过与宿主进行遗传信息交换，调控宿主基因表达［8，9］；又能产生抗生素或分泌毒素拮抗作物病原菌、虫害等间接促进植物生长［10，11］；还可利用内生菌资源进行微生物菌肥或生物农药的研发以替代化学农药或化学肥料进行生物防控、土壤修复改良等，进而实现生态系统保护，农业可持续发展［12－15］。由此可见，植物内生菌对宿主植物的生长、代谢、抗逆等生理活动有着重要的影响，在农业生产中具有广阔的应用前景。

我国传统中医药文化历史悠久，药用植物资源种类丰富，分布地域广阔，涵盖383科，2 309属，11 146种，仅临床常用植物药材就有700余种。药用植物因其生长环境的地域差异性和自身特殊的内环境和生理生化特点，加之物种和地域交叉等因素的影响，蕴藏着丰富而独特的内生菌资源［4，16］。据不完全统计，2010年之前的十多年间有关药用植物内生真菌的研究涉及我国药用植物21科44属62种2变种，仅占我国植物资源种类的5.7‰和临床常用植物药材的9.1%，对其研究和开发远远不够［17］。药用植物内生菌由于其特殊的内环境、微环境，从中筛选有价值的菌种资源的几率大大增加，其开发和利用是一项快速有效、可持续发展的新技术。随着环保意识的增强、绿色生态农业的可持续发展，将药用植物内生菌资源运用于农业研究与生产具有天然优势。本文对近些年药用植物内生菌在农业生产中的研究与应用进行综述，并对存在问题和发展前景进行探讨，以期为药用植物内生菌资源运用于农业生产提供借鉴。

1 药用植物内生菌在农业生产中的应用

1.1 药用植物内生菌能够促进植物生长发育

药用植物内生菌与宿主形成了许多共生互促机制，可通过多种途径促进植物的生长发育。如某些内生菌可以自身产生生长激素促进宿主生长［18］，或促进种子的萌发［19］，或促进根部营养的吸收［20］，或促进植物代谢物的积累［21］等。因此，利用内生菌的这些功能特点可以辅助解决植物栽培耕作和生长发育等过程中的难题。

郭顺星等［19］发现分离自兰科植物原球茎中的内生菌可以有效促进细叶石斛种子的萌发；无菌条件下播种无种子萌发，伴菌播种发芽率达20%以上；在内生真菌培养物的醇、水提取液培养条件下，种子发芽率高达40%～70%，但相比而言，内生菌丝伴播更有利于种子萌发形成的原球茎继续发育。张集慧等［21］发现分离自兰科药用植物的5株内生真菌可促进兰科药用植物生长发育，并从其发酵液和菌丝体中分别提取出5种植物激素，包括赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素和玉米核苷，对兰花的生长发育有着较好的促进作用；内生菌伴播可有效促进天麻、石斛等种子的萌发，研究为阐明内生真菌促进兰科药用植物生长发育机制提供了依据。福建金线莲［Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.］是一种常见的名贵药材，广泛用于高血压、糖尿病和肝炎等的治疗，由于长期采挖，野生资源濒临灭绝；通过组织培养可大量繁殖，但面临移栽成活率低、生长缓慢、难以养护成为有价值的商品等一系列问题。唐明娟等［22，23］从野生福建金线莲根中分离获得多种菌根真菌并对其生物活性进行研究，发现部分菌根真菌不但可与金线莲幼苗形成典型的菌根结构，而且对其生长具有显著促进作用，进一步研究发现在福建金线莲的家栽过程中可利用内生真菌提高其成活率、酶活性和产量。

1.2 药用植物内生菌可用于生物防治

植物病害是引起农作物品质下降、产量损失的主要原因之一。据统计大约80%的植物病害是由植物病原真菌引起的［24］。长期以来，植物真菌病害的防治主要以化学方法为主，而化学农药存在诸多弊端，如农药残留带来环境污染、危害人畜健康以及长期使用造成病原菌的耐药等问题。因此，寻找绿色、有效、可替代的产品用于植物病害防治成为农业可持续发展的关键问题［25］。

药用植物内生菌作为一类可持续利用的微生物资源，一方面可以提高植物的抗生物胁迫性［26，27］，另一方面能够代谢产生结构丰富、新颖的具有抗植物病原菌活性的代谢成分［28］，为防治植物病虫害提供了极大的可行性。药用植物内生菌用于防治植物病害已有诸多成功案例。许多研究表明，植物内生真菌的发酵液大多具有抗植物病原真菌活性［29，30］，并从中分离出许多活性物质［24］。Lu等［31］从黄花蒿内生真菌Colletotrichumsp.中分离鉴定的新活性代谢物ergosterol对小麦全蚀病、纹枯病、根腐病和疫霉病致病真菌具有有效的抑制作用。Li等［32］从雷公藤茎皮中分离得到的内生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina可以代谢产生独特的tetramic acid衍生物cryptocin，具有抗稻瘟病病原菌等多种植物病原真菌活性，但对人类病原真菌无活性。Xu等［28］从三七内生真菌Preussia isomeraXL－1326中分离得到一对新颖的降倍半萜（＋）和（－）preuisolactone A，具有显著的抗菌活性。Yang等［33］从蛇足石杉内生真菌Bionectriasp.Y1085中分离得到一系列具有显著抗菌活性的新颖代谢物。Wu等［34］从桑黄内生真菌Alternaria alternataShm－1分离得到一个新的2H－benzindazole混合物，具有中等抗C.michiganense活性。本课题组近些年针对山东省野生药用植物资源和多年道地产区家种药用植物资源内生菌开展了一系列研究，从泰山、徂徕山、沂蒙山等地采集野生药用植物资源50余种，生长环境遍及不同地形、海拔、气候等；同时从临沂、济南、泰安、淄博等山东省传统道地药材产区采集种植药材丹参、黄芩、金银花等药用植物10余种，从中分离内生真菌200余株，以小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）作为指示菌，采用平板对峙法和纸片扩散法分别对内生菌及其代谢产物进行了抗菌活性筛选，从中得到10株具有抗小麦赤霉病菌活性内生菌，相关研究仍在开展中。由此可见，将药用植物内生菌用于生物防治可为开发绿色农药提供新的资源并且潜力巨大。

1.3 运用植物内生菌开发微生物肥料，进行土壤修复及改良

在农业生产活动中，由于土地长时间连续耕作，往往面临营养贫瘠或连作障碍等问题，进而影响作物长势、产量和质量。另外，随着工业化的发展，生活垃圾废水的排放，以及农药化肥的使用，各种各样的污染物如有机污染物、重金属等排放到土壤中，给土壤带来严重压力。一方面造成土壤肥力退化、病害加重等，另一方面土壤污染日益严重，危及植物生长及人类发展，因此改善土壤质量、修复土壤污染成为农业生产生活不得不面临的严峻问题。微生物菌肥作为一种可持续利用资源，越来越受到人们的青睐，在改善土壤成分、提高肥力、促进植物生长方面潜力巨大。

王夏等［35］研究内生菌肥料对设施西瓜生长的影响，以西瓜品种‘小兰’为试材，采用苗期浇灌内生真菌菌剂和设施大棚内减少化肥用量配施微生物肥的方法进行试验，结果表明，内生菌剂处理（5 g／L）对西瓜幼苗有一定的促生作用，可增加根长、株高、叶面积等，同时可有效降低枯萎病的发生，提高幼苗的生物量、西瓜产量和品质。郎宸用［36］以龙高L2玉米品种和野生植物根系内生菌链格孢菌（Alternaria alternata）为材料，通过连续3年大田试验，研究了内生菌提取物对玉米生长的影响，综合比较发现，植物内生菌提取物可以显著影响玉米的生长发育，提高了成熟期玉米的百粒重、穗粒数和穗粒重，进而提高玉米产量。

土壤污染可简单划分为重金属污染、有机物污染，或两者复合污染等［37］。近些年，研究者发现植物内生菌具有改变植物摄取污染物或酶促降解污染物的能力，当微生物与植物联合时，植物可为微生物提供栖息地，而微生物也能通过增强植物的耐受性及降解污染物改善其生长环境，这种方法被认为是一种新型、有前景的生物修复方法［37］。

目前研究人员从多种植物中分离到具有修复土壤重金属污染的内生菌，如芥菜、蜈蚣草、商路、大豆、油菜等［37］。芦苇通常被用于处理废水或渗滤液，Sim等［38］从芦苇中首次分离得到一系列内生真菌，并对其对各种重金属的耐受性和生物吸附潜力进行了筛选，结果表明，21株内生菌均表现出重金属耐受性（包括Cd2＋、Cu2＋、Cr2＋、Pb2＋、Zn2＋等），其中以Trichoderma asperellumIso11，Phomopsissp.Iso9 andSaccharicola bicolourIso22三株菌耐受力最强；进一步研究表明，与Phomopsissp.Iso9和S.bicolourIso22相比，T.asperellumIso11对各种重金属均表现出较好的耐受性和适应性，对金属的适应浓度高达2 000 mg／L；三种内生菌在单金属溶液中均具有去除效果，在多金属溶液中，T.asperellumIso11和S.bicolourIso22对Cu2＋的吸附亲和力较高，其次是Cr3＋和Pb2＋，而Phomopsissp.Iso9对重金属的亲和性顺序为Cu2＋＞Pb2＋＞Cr3＋。多环芳烃是一类具有毒性的环境污染物，由于人类活动在环境中大量累积。Dai等［39］为了探索更多具有多环芳烃生物修复功能的内生菌资源，以菲作为模型化合物，从4种大戟科植物中分离到9株内生真菌，并对其菲降解进行了筛选，其中分离自重阳木（Bischofia polycarpam）的内生真菌Ceratobasidum stevensiistrain B6具有较高的降解效率，在该内生真菌培养过程中加入100 mg／L菲，培养10天后大约89.51%的菲被消除。

以上研究充分表明，植物内生菌以微生物菌肥的方式作为一种绿色环保、可持续利用的资源，在改善土壤质量、修复土壤污染方面具有广阔前景。

1.4 内生菌能够提高植物抗逆性

植物的抗逆性是指植物具有的抵抗外界不利环境的某些性状，如抗旱、抗寒、抗盐、抗病虫害等，这些不利环境因素又可分为非生物胁迫（高温、干早、高盐碱等）和生物胁迫（病原菌、昆虫、食草动物等）。一系列研究表明，内生菌与宿主长期生长进化过程中，能有效促进植物对生物胁迫和非生物胁迫的耐受，形成一定抗逆性，增强其适应性，这种适应性的增强包括对食草性哺乳动物和昆虫、病原菌和线虫等的抵抗力，以及宿主的耐旱性和竞争力等［26，27］。借此可将其运用于农业生产以提高作物对干旱或盐碱地等恶劣环境的适应。

自然生态系统中的所有植物都被认为与菌根真菌和／或内生真菌共生。经过4亿多年的进化，一些植物仍然不能依靠自身而需要通过其内生真菌提高耐胁迫性，通过对高胁迫生境中植物内生菌的分析，发现至少有一些内生真菌赋予其寄主植物对特殊生境的耐受性，离开了这些内生菌，宿主植物无法在原生栖息地生存［40］。如受内生菌感染的冷季禾本科植物可逐渐适应外界环境（干旱和矿物质缺乏）的胁迫［41］。

Redman等［42］研究表明，生长于美国黄石公园的植物Dichanthelium lanugunasum只有在与其优势弯孢属内生真菌Curvularia protuberata共生的情况下才能适应38℃的地热高温环境，而单独培养条件下宿主植物Dichanthelium lanugunasum则无法存活。王贵生等［43］研究发现分离自亳菊的1株柄孢壳菌属（Zopfiellasp.）内生菌BJF10对玉米弯孢菌、黄瓜枯萎菌、小麦赤霉菌、茶叶轮斑菌均具有拮抗作用和降解纤维素、抗氧化等生物活性。Rodriguez等［44］证明来自沿海和地热生境的原生植物分别需要借助共生真菌来耐受盐和热环境，而在没有盐或热胁迫的生境中，从植物分离得到的同一种内生真菌却不具有这些胁迫耐受能力；源自农作物的内生真菌具有抗病性，却不具有耐盐性或耐热性；研究者分别将农作物、沿海植物和地热植物中的内生菌在番茄上定植，最终分别获取了抗病性、耐盐性和耐热性能；此外，沿海植物内生菌在水稻上定植则赋予了水稻耐盐性；不管被定植植物原始栖息地在何处，耐旱胁迫环境下植物内生菌也会赋予其耐旱能力，这种内生真菌赋予植物抗逆性的能力或许为减轻全球气候变化对农业和原生植物群落的影响提供一种新的策略。

自然界中某种植物出现的优良抗逆性状，因为不同物种间存在的生殖隔离，在自然条件下很难转移到其他种类的植物上，而通过植物内生菌的这种“促抗作用”作为媒介或许能为解决这一难题提供方案。植物内生菌进入宿主植物后，能胁迫宿主植物开启植物抗逆有关的基因，增强这些基因的表达，提高与抗逆有关的酶活性，从而增强宿主植物的抗逆性［20］。另一方面，植物内生菌也可通过产生抗生素、水解酶、植物生长调节剂等成分，增强宿主的抵抗力以及诱导其产生系统抗性［45，46］。药用植物生长环境多样，野生栖息地一般营养贫瘠或气候恶劣，这种特殊环境往往也塑造了其内生菌的特殊性以及对胁迫环境的适应性，因此运用药用植物内生菌资源研究植物的抗逆性具有不可替代的优势。

1.5 运用内生菌资源对植物遗传育种进行改良

传统植物育种的方法是以自然突变和有性杂交为基础，而由于物种间存在生殖隔离，具有一定局限性，随着基因工程研究的发展，运用分子生物学技术对植物基因进行编辑等为植物遗传育种开辟了更广阔的空间［47］。药用植物内生菌与宿主植物长期协同进化过程中，逐渐形成了特有的基因特征、生态特性，发掘这些功能基因并加以应用将为植物遗传育种开辟新途径。此外，由于微生物基因组相对较小，遗传操作相对容易，可为通过分子生物学手段进行遗传改良提供先天条件；引入内生菌资源与植物联合培育在改良植物品种、植物表型方面也发挥着重要作用。

小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性且防治困难的真菌病害，培育与利用抗病品种是首要选择。Wang等［48］首次从小麦近缘植物长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病基因Fhb7，研究表明Fhb7是通过水平基因转移从内生真菌转入植物，该研究为解决小麦赤霉病世界性难题找到了“金钥匙”。郜庭等［49，50］运用分子生物学和植物细胞工程等技术，从优良湿地植物中挖掘内生菌资源，并解析其中功能内生菌的金属耐受性及促生机制，随后进一步将功能内生菌的利用拓展至湿地植物育种方向，为湿地植物品种改良提供了新思路。

1.6 运用内生菌开发微生物源绿色防腐保鲜剂或食品添加剂

农产品及食品在长时间贮藏过程中容易因发生氧化或细菌、真菌等的污染而导致腐败变质，前者可以通过添加具有抗氧化活性物质来延长其保质期，后者则可以通过添加具有抗菌活性物质作为食品添加剂改善和延长保质期。研究发现一些药用植物内生菌可以代谢产生许多具有抗氧化活性和抗菌活性的物质，将其进一步开发运用于微生物源绿色防腐保鲜剂或食品添加剂具有巨大潜力，尤其一些具有类似于益生菌作用的药用植物内生菌，在食品加工与保藏方面更是前景广阔。

p－酪醇是一种天然抗氧化剂，是所有红景天属植物的主要生物活性成分。红景天是一种稀有濒危高山植物，被广泛用作食品和药物添加剂，其主要有效成分就包括p－酪醇，具有抗高原反应、抗衰老、保护细胞免受氧化伤害等药理活性。Cui等［51］研究分离自红景天植物的内生真菌Phialocephala fortiniiRac56，其发酵产物经UPLC／QTOF-MS和1H-NMR分析发现，该内生菌也能够代谢产生p－酪醇，经发酵条件优化产量可达2.002 mg／mL。这一研究结果为通过内生菌发酵获取该天然抗氧化剂提供了新途径。刘雅莉等［52］从蒺藜内生真菌中筛选得到一株抗氧化活性较好的菌株JL13，其发酵产物具有较强的清除DPPH·自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的能力，EC50依次为149.67、439.91、514.77μg／mL，结果表明蒺藜内生真菌具有较好的抗氧化潜力和一定的开发利用价值。张新国等［53］从药用植物乌头、唐松草、独活、车前草、薄荷、泽泻中分离得到43株内生真菌和18株放线菌；抗氧化活性筛选显示6株内生真菌具有较好的抗氧化活性，对·OH自由基清除率≥70%，其中1株链格孢菌属Alternariasp.DHL－10发酵液乙酸乙酯提取物对过氧化氢的IC50为0.26 mg／mL，显示了较强的抗氧化活性，总酚和总黄酮含量分别达到（0.81±0.05）mg／g和（0.84±0.05）mg／g。这一研究结果为从药用植物内生菌中发现抗氧化活性物质提供了资源。本课题组采用DPPH·自由基清除试验评价200余株药用植物资源内生菌抗氧化活性，其中代谢产物具有抗氧化活性菌株近40株，比例达20%。由此可见，从药用植物内生菌中筛选并开发微生物源绿色防腐保鲜剂或食品添加剂具有巨大潜力。

除此之外，在农业生产生活中，药用植物内生菌资源还可用来开发动物饲料或添加剂，或是开发兽药，用于防治动物致病菌和动物防疫抗生素的研发，以及运用内生菌进行黄曲霉素防控、农用地膜降解等。由此可见，药用植物内生菌资源在农业生产生活中的研究与应用非常广泛并且具有广阔前景。

2 总结与展望

我国地域广阔，药用植物资源极其丰富，植物种类和地域差异等因素使得其中孕育了更为多样的内生菌资源，是一个亟待开发的巨大宝库。随着微生物组学、基因组学和合成生物学等新兴技术的兴起，内生菌研究也得到越来越多的关注，并积累了大量的菌种资源。

关于药用植物内生菌方面的研究仍存在一些问题：理论研究较多，产业化水平较低，仍需下大力气，结合农业生产生活需求，促进内生菌理论成果的应用转化；药用植物内生菌的研究主要以活性次生代谢产物筛选鉴定居多，其他方面研究仍相对欠缺，如可用于作物育种的功能基因发掘和农业生产功能酶的开发等；内生菌与植物之间存在着密切关系，两者间的互作关系方面研究仍相对薄弱，内生菌在植物生长过程中扮演着重要角色，而这一角色如何发挥作用即药用植物内生菌的微生态效应值得开拓；随着组学时代的到来，传统内生菌研究主要围绕单一菌株展开，下一步可结合组学技术开展药用植物内生微生物组方面研究以进一步揭示内生菌与植物之间的密切联系等。

随着生产和生活水平的提高，人们对农业生产全链条、生活食品全过程的品质追求越来越高。药用植物内生菌种类丰富、活性广泛，同时具有生长迅速、循环持续、绿色生态等一系列优势，合理有效开发并利用药用植物内生菌资源不仅在农业科学研究方面具有重要的理论意义，而且在农业生产和生活中具有广阔的应用价值。