反相高效液相色谱法测定保健品中反式维生素K1的含量

2021-08-29罗文芳张秋华

理化检验-化学分册 2021年8期

罗文芳,张秋华,王涛

(江西兄弟医药有限公司,九江 332700)

维生素K1又称凝血维生素,化学名为2-甲基-3-(3,7,11,15-四甲基十六-2-烯基)-1,4-萘醌,是肝脏合成凝血酶原的必需物质,具有重要的凝血功能,当体内缺乏时会造成凝血障碍[1-2]。维生素K1常作为一种营养补充剂添加到保健品中,对于维生素K1缺乏症有很好的预防作用。维生素K1的化学结构式见图1,其分子侧链上有一个双键,因而存在顺反异构体,天然产物中的维生素K1主要以反式构体存在。大部分药物分子因其异构特性而具有不同的生物活性,从而产生相应的不良反应。为了减少药物异构特性带来的不良反应,对异构体进行拆分是现代药物研究的重大趋势[3]。

图1 维生素K1的化学结构式Fig.1 Chemical structure of vitamin K1

膳食补充剂中通常使用合成的维生素K1,其中可能含有一定的顺式结构。维生素K1反式构体具有生物活性,而顺式构体不具备[4]。因此,为了能够更好地评价其营养价值成分,对维生素K1顺反异构体的拆分研究显得尤为重要。目前,药典中多使用液相色谱正相体系、C30色谱柱[5]、超临界流体色谱作为分离方法条件对维生素K1顺反异构体进行拆分。检测维生素K1的方法主要有电化学法[6-7]、荧光光谱法[8-10]、高效液相色谱法[11]、色谱-串联质谱法[12-13]等,这些方法操作复杂且成本高,不利于生产过程中多批次样品的连续分析。本工作选用常规的流动相和Phenyl柱,能够较好地分离维生素K1的顺反异构体,并对反式维生素K1进行检测,方法简单、快速、节约成本。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000型高效液相色谱仪,配Chromeleon色谱工作站、四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器;ML204T 型分析天平(感量0.000 01 g);KQ-250B型超声波仪器。

混合标准储备溶液:称取8 mg反式维生素K1标准品,2 mg顺式维生素K1标准品溶于100 mL棕色容量瓶中,用异丙醇溶解、定容,配制成反式维生素K1质量浓度为80 mg·L－1和顺式维生素K1质量浓度为20 mg·L－1的混合标准储备溶液。

混合标准溶液系列:移取一定量的混合标准储备溶液,用异丙醇逐级稀释,配制成反式维生素K1质量浓度为0.04,0.4,0.8,2,4,8 mg·L－1和顺式维生素K1质量浓度为0.01,0.1,0.2,0.5,1,2 mg·L－1的混合标准溶液系列。

顺、反式维生素K1标准品纯度为98%;试验所用3个品牌的维生素K1补充片剂规格100μg/1 g。

甲醇为色谱纯;异丙醇、冰乙酸为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Zorbax SB-Phenyl色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流量0.8 mL·min－1;柱温25 ℃;紫外检测波长260 nm;流动相A 为甲醇,B为50 mmol·L－1乙酸溶液。梯度洗脱程序:0～15 min 时,B 为80%;15～35 min时,B 为95%;35～45 min时,B为80%。

1.3 试验方法

将维生素K1补充片剂研磨成粉后,称取0.25 g样品,用异丙醇溶解,并定容至50 mL 棕色容量瓶中,用0.45μm 滤膜过滤,取上清液,将其稀释成质量浓度为100 mg·L－1的样品溶液,按照仪器工作条件进样测定。

2 结果与讨论

2.1 溶样溶剂的选择

试验需要在反相体系下测定维生素K1,因此需要选择一种既能溶于正相又能溶于反相的溶剂,故优选异丙醇。对混合标准溶液进行10次重复测定,计算顺、反式维生素K1的保留时间、峰面积、分离度(Rs)以及它们的相对标准偏差(RSD),结果如表1所示。

表1 混合标准溶液的分析结果(n＝10)Tab.1 Analytical results of the mixed standard solution(n＝10)

结果表明:异丙醇对脂溶性维生素K1有较好的溶解性;在反相体系中测定维生素K1时,峰面积和保留时间表现出较好的重现性。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱

根据维生素K1的主要特性,目前常用正相体系或反相体系的手性柱、C30色谱柱对其进行拆分。而手性柱和C30色谱柱价格昂贵,不利于大批量样品的检测。试验先考察了Interil ODS-3 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Zorbax SB-AQ 色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)等普通C18色谱柱对维生素K1的分离效果。结果表明,Interil ODS-3 色谱柱和Zorbax SB-AQ 色谱柱均无法对维生素K1异构体起到拆分的作用,上述色谱柱需借助超临界流体色谱体系进行拆分。考虑到维生素K1具有较大的苯环结构,试验选择Zorbax SB-Phenyl色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)进行试验,达到了较好的分离效果。

2.2.2 流动相

当以甲醇和水为流动相时,顺、反式维生素K1的分离度为0.96,异构体没有完全分离。通过加入改性试剂乙酸,可提高顺、反式维生素K1的分离度。试验考察了不同乙酸浓度(30,40,50,60,70 mmol·L－1)对顺、反式维生素K1分离度的影响,结果如图2所示。

图2 乙酸浓度对顺、反式维生素K1 分离度的影响Fig.2 Effect of concentration of acetic acid on the resolution of cis-and trans-vitamin K1

由图2可知:当乙酸浓度为50 mmol·L－1时,顺、反式维生素K1分离度最高,因此试验选择乙酸浓度为50 mmol·L－1。

2.2.3 梯度洗脱程序

试验首先通过调节甲醇与50 mmol·L－1乙酸溶液的体积比,等度洗脱维生素K1混合标准溶液。考察了不同体积比(40∶60,50∶50,60∶40,70∶30,80∶20,90∶10)的甲醇-50 mmol·L－1乙酸溶液体系对反式维生素K1洗脱效果的影响,如图3所示。

图3 甲醇与50 mmol·L－1乙酸溶液的体积比对反式维生素K1 洗脱效果的影响Fig.3 Effect of volume ratio of methanol to 50 mmol·L－1 acetic acid solution on elution effect of trans-vitamin K1

由图3可知:当甲醇与50 mmol·L－1乙酸溶液的体积比为80∶20时,反式维生素K1的峰面积最高,洗脱效果较好,因此试验选择体积比80∶20作为甲醇-50 mmol·L－1乙酸溶液洗脱的起始比例。

为了将维生素K1异构体快速洗脱,节省分析时间,在梯度洗脱中间过程,增加甲醇与50 mmol·L－1乙酸溶液的体积比至95∶5。