超声提取-凝胶渗透色谱法净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸭肠及其制品中6种常见抗生素的残留量

宁方尧,温 韬

(1.广西工业职业技术学院,南宁 530001;2.广西壮族自治区产品质量检验研究院,南宁 530000)

鸭肠是深受广大老百姓喜爱的动物内脏之一,其不仅味道鲜美、香脆可口,还可以对人体神经系统、视觉系统、消化系统及新陈代谢起到维护作用[1-4]。鸭肠在食用方面可以卤制、炒制、烫火锅、炖汤等,市场上有大量预包装、散装鸭肠及其制品在售,其中新鲜鸭肠的销量较大。但鸭子在养殖、培育过程中常会受到病菌、微生物等影响,进而导致患病,如鸭流感等,其以虎斑心为主要症状,在局部地区发病率较高,该病症会导致鸭子呼吸困难、腹泻,死亡率高。因此,养殖户常使用抗生素以防治鸭子患病[5-7],常用的抗生素主要有替米考星、罗红霉素、红霉素等大环内酯类,氧氟沙星、环丙沙星等喹诺酮类和氟苯尼考等四环素类。抗生素在使用过程中,大部分不能被鸭子充分吸收和代谢,一部分残留在动物体内,尤其在内脏中残留量较大;另一部分则通过排泄物、养殖废水等方式进入到环境中,直接或间接地对人体健康造成危害[8-13]。因此,加强对鸭肠及其制品中抗生素残留的检测,对指导规范养鸭、保护人体健康等具有重要的意义。

文献[14-16]等报道了高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中4种喹诺酮类药物的方法,而关于鸭肠及其制品中抗生素残留的检测研究报道极少。本工作采用超声提取法将鸭肠及其制品中替米考星、罗红霉素、红霉素、氧氟沙星、环丙沙星、氟苯尼考等常见抗生素提取出来,以凝胶渗透色谱法(GPC)净化后,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLCMS/MS)对上述6 种抗生素进行定性分析和定量测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Shimadzu LC-30 A 型液相色谱-串联质谱仪,配自动控温进样器、四元高压泵、AB Sciex Triple QuadTM4500型质谱检测器;KQ-3200型水浴超声仪;GPC 1000型凝胶净化色谱;IKA T25型组织匀浆机;QUINTIX 2102-1CN 型电子天平;Beckman Neofuge 18R型冷冻离心机;Milli-Q Direct 16 型超纯水仪。

6种抗生素单标准溶液:100.0μg·L－1,移取6种抗生素单标准储备溶液适量,用甲醇逐级稀释,配制成质量浓度为100.0μg·L－1的单标准溶液。

混合标准储备溶液:称取6种抗生素标准物质各约20 mg,用甲醇溶解并分别定容至100 mL容量瓶中;分别移取0.5 mL 上述溶液于同一个10 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容配制成6种抗生素质量浓度均为10.00 mg·L－1的混合标准储备溶液。

混合标准溶液系列:移取一定量的混合标准储备溶液,用体积比1∶1的甲醇-乙腈混合液逐级稀释,配制替米考星、罗红霉素、红霉素、氧氟沙星、环丙沙星和氟苯尼考质量浓度为0.01,0.05,0.20,0.40,2.00,5.00,10.00 mg·L－1的混合标准溶液系列。

替米考星标准物质(BW 1935-50 mg,质量分数99.0%)、罗红霉素标准物质(SH-B20801-200 mg,质量分数98.2%)、红霉素标准物质(SH-B20801-200 mg,质量分数98.6%)、氧氟沙星标准物质(GBW(E)061889,质量分数99.9%)、环丙沙星标准物质(BW 1752-100 mg,质量分数98.4%)、氟苯尼考标准物质(BW 1683-100 mg,质量分数98.1%)。

甲醇、丙酮、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯;试验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

1)GPC条件Sephadex LH-20色谱柱(250mm×5 mm,10μm);洗脱剂为体积比95∶5的甲醇-乙腈混合液;流量3.5 mL·min－1。

2)超高效液相色谱条件 Waters UPLC BEH C18色 谱 柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱 温35 ℃;流量0.25 mL·min－1;进样体积10μL;流动相A 为体积比1∶1的甲醇-乙腈混合液;流动相B为0.2%(体积分数)甲酸溶液。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

3)质谱条件 电喷雾离子源(ESI),正离子模式;离子喷雾电压5 500 V;气帘气压力344.8 kPa;辅助气压力517.1 k Pa;雾化器压力379.2 k Pa;离子源温度560 ℃;多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表2。

表2 质谱参数Tab.2 MS parameters

1.3 试验方法

将鸭肠或鸭肠制品用组织粉碎机粉碎后,取粉碎后的样品12.0 g置于50 mL塑料离心管中,依次加入甲醇30 mL、氨水1.0 mL、除水剂无水硫酸钠3.0 g,均质1 min,超声(功率200 W,频率40 Hz)提取15 min,取出冷却至室温,以转速8 000 r·min－1冷冻离心6 min,将上清液全部转移至GPC 净化瓶中,按GPC 条件进行样品净化。收集1 000～2 400 s的淋洗液,将其置于氮吹仪中,于45 ℃氮吹至近干,残渣用1 mL甲醇溶解,经0.45μm 滤膜过滤,滤液按仪器工作条件进行测定。

Analysis of the Present Situation and Existing Problems of Dianchi Wetland Park——A Case Study of Wujiadui Wetland Park________________________LI Yuntao 28

2 结果与讨论

2.1 净化方法的选择

超声提取鸭肠及其制品中待测目标物抗生素时,基质中与抗生素类似的干扰物质也会被提取出来,如果直接进样,则会因基线噪声大导致检测结果的灵敏度、准确度降低,并对色谱-质谱系统造成损害。常用于抗生素残留检测的前处理方法主要有液液萃取法(LLE)、GPC 和固相萃取法(SPE)等。LLE操作简便,但处理时间长,萃取效率低且净化效果差,不适用于鸭肠中抗生素残留的检测。SPE自动化程度高,但处理步骤冗长,过柱时易造成待测物损失,检测准确度偏低。GPC 是通过色谱柱进行分离,并截取待测物出峰前后的溶液,净化效果好,且损失小。试验分别采用上述不同方法对加标样品溶液(加标量0.1 mg·L－1)净化,净化后的溶液按仪器工作条件进行测定,考察了不同净化方法对6种抗生素回收率的影响,结果见表3。

表3 净化方法对6种抗生素回收率的影响Tab.3 Effect of purified method on recovery of 6 antibiotics

由表3可知,与LLE和SPE相比,样品经GPC净化后所得各待测物的回收率较高,因此试验选择GPC作为净化方法。

2.2 GPC条件的优化

在GPC系统中,常用的色谱柱主要有以葡聚糖凝胶为固定相的Sephadex LH-20型色谱柱和以聚苯乙烯凝胶为固定相的Bio-beads SX-3型色谱柱。试验所研究的抗生素均极性较强,易溶于甲醇。Sephadex LH-20型色谱柱是亲水亲脂型填料,可以使用甲醇、乙腈等强极性溶剂作为洗脱剂,更适用于6种抗生素的洗脱。试验初始选择甲醇作为洗脱剂,保持其他GPC条件不变,结果显示,氧氟沙星和环丙沙星色谱峰拖尾且出峰时间较晚,因此试验选择在洗脱剂甲醇中加入强洗脱能力的乙腈,考察了以体积比为97.5∶2.5,95∶5,92.5∶7.5,90∶10的甲醇-乙腈混合液为洗脱剂时6种抗生素的分离效果。结果表明,以体积比95∶5的甲醇-乙腈混合液为洗脱剂时,6 种抗生素峰形较好,且分析时间较短。因此,试验选择以Sephadex LH-20 型色谱柱为分离柱,以体积比95∶5的甲醇-乙腈混合液为洗脱剂。

2.3 MRM 模式条件的优化

以替米考星为例,取100μg·L－1替米考星标准溶液,设定质谱扫描模式为全扫描模式(Q1 Scan),找到替米考星母离子;根据找到的替米考星母离子,设定质谱扫描模式为产物离子扫描模式,找到替米考星产物离子,选择响应较强的2个产物离子,其中1个作为定量离子,另外1 个作为定性离子;最后对替米考星母离子和2个产物离子进行DP和CE优化,建立替米考星的MRM 模式条件。同法建立罗红霉素、红霉素、氧氟沙星、环丙沙星和氟苯尼考的MRM 模式条件,优化结果见表2。

2.4 色谱行为

按照仪器工作条件,对0.20 mg·L－1混合标准溶液和加标样品溶液(加标量为0.20 mg·L－1)进行测定,得到的总离子流色谱图见图1。

图1 混合标准溶液和加标样品溶液的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of mixed standad solution and spiked sample solution

2.5 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件,对替米考星、罗红霉素、红霉素、氧氟沙星、环丙沙星和氟苯尼考质量浓度为0.01,0.05,0.20,0.40,2.00,5.00,10.00 mg·L－1的混合标准溶液系列进行测定。以各抗生素的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,6种抗生素的线性范围均为0.01～10.00 mg·L－1,线性回归方程和相关系数见表4。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表4。

表4 线性参数及检出限Tab.4 Linearity parameters and detection limits

2.6 精密度和回收试验

对样品进行0.01,0.20,4.00 mg·L－1等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平配制6份,按试验方法进行测定,并计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表5。

表5 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 重复性试验

按照试验方法处理样品,制备含6种抗生素质量浓度为0.10 mg·L－1的加标样品溶液,平行配制6份。按照仪器工作条件,对上述样品溶液进行重复性试验,并计算测定值的RSD。结果显示,替米考星、罗红霉素、红霉素、氧氟沙星、环丙沙星和氟苯尼考测定值的RSD依次为3.7%,2.3%,2.9%,3.2%,4.0%,4.3%,表明此方法具有良好的重复性。

2.8 样品分析

按照试验方法分别对市售的鸭肠及其制品中6种抗生素的含量进行测定,结果见表6。

表6 样品分析结果Tab.6 Analytical results of the samples

结果显示:在鲜鸭肠中检出替米考星和氟苯尼考,在鸭肠串中检出氧氟沙星和氟苯尼考,而在卤制鸭肠中未检出目标抗生素。

本工作采用超声提取和GPC 净化技术,结合UHPLC-MS/MS建立了测定鸭肠及其制品中6种抗生素残留量的分析方法。该方法具有检出限低、精密度和重复性好等优点,适用于鸭肠及其制品中残留抗生素的测定,可为完善国家监管技术提供参考。