可同时检测毒死蜱、异菌脲残留的荧光试纸条研制及其应用

吴小胜，崔廷婷，王兆芹，惠光鹏，赵正苗，万宇平

可同时检测毒死蜱、异菌脲残留的荧光试纸条研制及其应用

吴小胜1,2，崔廷婷1,2，王兆芹1,2，惠光鹏1,2，赵正苗1,2，万宇平2*

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京）

本文利用毒死蜱单克隆抗体、异菌脲单克隆抗体，研制出一种能够检测果蔬加工副产品类饲料中毒死蜱、异菌脲的荧光免疫层析矩阵试纸条。毒死蜱检测限为叶菜类加工副产品类饲料0.5 mg/kg，根茎类加工副产品类饲料1 mg/kg；果蔬加工副产品类饲料中异菌脲检测限为5 mg/kg，检测时间为5 min，假阳性率和假阴性率均为0，符合《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》要求，试纸条能够应用到基层实验室的大批量样本检测，具有实际意义，并且未见同时检测毒死蜱、异菌脲的二合一荧光免疫层析试纸条的相关文献报道，具有创新性。

毒死蜱；异菌脲；荧光免疫层析试纸条；快速检测

毒死蜱和异菌脲均属于果蔬中典型残留农药，毒死蜱是乙酰胆碱酯酶抑制剂，属硫代磷酸酯类杀虫剂，中毒症状表现为抽搐、痉挛、恶心、呕吐等。异菌脲是二甲酰亚胺类高效广谱、触杀型杀菌剂，对水生生物有极高毒性，可对水体环境产生长期不良影响，在养殖过程中，动物可能通过饮食摄入，对动物造成伤害，影响畜牧养殖业。因此，研究开发毒死蜱和异菌脲的检测技术和方法具有重要意义。

目前传统检测毒死蜱的仪器方法有比色光谱法[1]、气相色谱法[2]、气相色谱-串联质谱法[3-4]、超高效液相色谱-串联质谱法[5]、电化学传感器法[6]等；传统检测异菌脲的仪器方法有气相色谱-串联质谱法[7]、气相色谱法[8-10]、高效液相色谱法[11-12]等。上述仪器方法成本高，用时较长，而免疫化学检测法具有低成本、用时较短、特异性较强等优点[13-14]。本文制备出一种毒死蜱单克隆抗体和异菌脲单克隆抗体，将其用于制备荧光免疫层析试纸条，费用及检测时限均能够满足基层实验室的检测需求，该产品已市场化，应用于畜牧养殖业，保证畜产品质量，具有实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 白菜、马铃薯、皇冠梨等果蔬加工副产品类饲料，购自北京某超市。

1.1.2 样品与仪器 毒死蜱、异菌脲等标准品（纯度≥95 %）购自北京标准物质研究中心，羊抗鼠抗抗体、荧光分析仪由北京勤邦生物技术有限公司提供；时间分辨荧光微球购自苏州为度生物技术有限公司；涡旋仪购自湖南湘立科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 毒死蜱半抗原的制备 毒死蜱原药与氨基丁酸在四氢呋喃中加热，反应完成后，碱溶解，萃取，水相调节pH，萃取，得到粗品，柱层析纯化分离，得到半抗原产物[15]。

1.2.2 异菌脲半抗原的制备 以2，6-二氯-4-硝基苯酚为起始原料，经烃基化反应，硝基还原反应，芳香胺的酰基化反应，成环反应，亚胺的酰化反应以及叔丁酯水解等反应，合成了带有四碳链长度的羧基半抗原产物，具体方法如下[16]：

图1 毒死蜱半抗原合成路线

化合物a的合成：5.0 g 2，6-二氯-4-硝基苯酚与3.2 g 4-溴丁酸叔丁酯在丙酮中搅拌，加2.6无水碳酸钾催化，60 ℃ 反应8 h。反应停止后，蒸出溶剂，加水与乙酸乙酯萃取，有机层加入无水硫酸钠干燥，浓缩，过200-300目硅胶柱，用吸附柱色谱进行层析分离纯化，得到化合物a 5.23 g，收率87 %。

化合物b的合成：锌粉3.1 g加水20 ml，冰乙酸1 ml，90 ℃ 反应30 min，加5.2 g化合物a的乙醇溶液80 ml，60 ℃ 反应4 h。停止反应，抽滤，蒸干，加水与二氯甲烷萃取，静置，有机层加入无水硫酸钠干燥，石油醚/乙酸乙酯20/1重结晶，得到化合物b 4.8 g，收率91 %。

化合物c的合成：化合物b 4.7 g加乙腈100 ml溶解，搅拌，加氨基乙酸2.16 g，氮气保护下，通入碳酰氯，50 ℃ 反应7 h。停止反应，加氢氧化钠水溶液50 ml，震荡，旋蒸，除去乙腈，加乙酸乙酯溶解，加水洗涤，浓缩，蒸干，过200～300目硅胶柱，用吸附柱色谱进行层析分离纯化，得到化合物c 3.57 g，收率73 %。

图2 异菌脲半抗原合成路线

化合物d的合成：化合物c 3.4 g加1，2-二氯乙烷溶解，加DMF 0.5 ml，加草酰氯3 ml，室温搅拌3 h，旋蒸蒸干，除去有机溶剂，加吡啶80 ml溶解，80 ℃ 反应7 h。停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去吡啶，加乙醇-石油醚（10:3，v/v）加热溶解，4 ℃ 放置过夜，抽滤，得到化合物d 2.97 g，收率82 %。

化合物e的合成：化合物d 2.8 g加1，2-二氯乙烷200 ml溶解，加异丙胺2.7 ml，通入氮气，排除空气，通入碳酰氯，室温搅拌反应6 h。停止反应，加KOH水溶液50 ml震荡，静置，分出有机相，水洗，无水硫酸钠干燥蒸干，过200～300目硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯（1:1）洗脱分离，得到化合物e 1.53 g，收率64 %。

化合物f的合成：取化合物e 1.53 g，加70 % 甲酸水溶液100 ml溶解，70 ℃ 搅拌反应6 h，停止反应，旋蒸，除去溶剂，加氢氧化钠水溶液，加乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相调节pH值到4，加1，2-二氯乙烷萃取，水洗，干燥，蒸干，乙醇/正己烷（6:4，v/v）重结晶，得到白色固体0.81 g，收率77 %。

1.2.3 单克隆抗体的制备 将1.2.1制备的毒死蜱半抗原、1.2.2制备的异菌脲半抗原分别与牛血清白蛋白偶联，得到毒死蜱免疫原、异菌脲免疫原。分别用毒死蜱免疫原、异菌脲免疫原免疫Balb/c小鼠，免疫剂量为150 μg/只，使其产生抗血清。小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 ℃ 水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5 ml/只，7 d后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×105个/只，7 d后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20 ℃ 保存。即得到毒死蜱单克隆抗体、异菌脲单克隆抗体。将1.2.1制备的毒死蜱半抗原、1.2.2制备的异菌脲半抗原分别与卵清白蛋白偶联，得到毒死蜱包被原、异菌脲包被原。

1.2.4 制备毒死蜱、异菌脲残留二合一荧光试纸条 1.2.3制备的毒死蜱单克隆抗体、异菌脲单克隆抗体分别用荧光微球标记，具体方法如下：（1）取荧光微球悬液100 μl混悬于900 μl活化缓冲液中，于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min后弃上清，重悬微球于1 ml活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温震荡活化10 min；（2）将（1）所述混悬液于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min后弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入10～20 μl抗毒死蜱单克隆抗体溶液/异菌脲单克隆抗体溶液（蛋白浓度1 mg/ml），混匀后室温震荡偶联120 min；（3）将（2）所述混悬液于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min后弃上清，重悬于封闭缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温震荡封闭30 min；（4）将（3）所述混悬液于4 ℃ 10 000 r/min离心10 min后弃上清，重悬于贮存缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4 ℃ 避光保存。将上述荧光微球标记的抗体分别喷涂到试纸条的结合物释放垫上，在检测线1（T1线）上包被毒死蜱包被原，在检测线2（T2线）上包被异菌脲包被原；在质控线（C线）上包被羊抗鼠抗抗体。组装上述结构，制备出毒死蜱、异菌脲残留二合一荧光试纸条。

1.2.5 检测方法 检测前样品应恢复至室温，取新鲜样品擦去泥土，剪碎成小于1 cm见方的碎片。称取1.00 ± 0.05 g样品至15 ml聚苯乙烯离心管中，再加入5 ml提取液，盖上盖子，手动上下振荡30s，静置1min，得样品溶液。

用吸管吸取上述样品溶液垂直滴加2～3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5min，通过荧光分析仪读取检测结果。其它时间判读无效。

图3 毒死蜱、异菌脲残留二合一荧光试纸条

1.2.6 样本检测限 在空白白菜样本中添加毒死蜱标准品至质量浓度为0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/kg，在空白马铃薯样本中添加毒死蜱标准品至质量浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg，在空白白菜样本以及皇冠梨样本中分别添加异菌脲标准品至质量浓度为0、2.5、5、7.5、10 mg/kg。按照1.2.5所述方法用三批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限[17]。

1.2.7 试纸条的特异性 《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》规定：采用与待检药物同类药物、类似物或可能联合使用的药物测定特异性，因此，分别配制10 mg/kg的腐霉利、啶虫脒、灭蝇胺等药物，用试纸条重复检测3次，判断试纸条的特异性。

1.2.8 准确性 农业部文件要求：以假阳性率和假阴性率表示荧光免疫层析法的准确性[17]。取经仪器确证的50份阴性果蔬样品（质量浓度小于检测限），50份阳性果蔬样品（质量浓度大于检测限），用该试纸条进行检测毒死蜱、异菌脲药物残留，计算假阳性率和假阴性率[17]。《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》规定：试纸条假阳性率应小于5 %，假阴性率应为零[17]。

2 结果与分析

2.1 样本检测限

在空白白菜样本中添加毒死蜱标准品至质量浓度为0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/kg，在空白马铃薯样本中添加毒死蜱标准品至质量浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/kg，在空白白菜样本以及皇冠梨样本中分别添加异菌脲标准品至质量浓度为0、2.5、5、7.5、10 mg/kg。按照1.2.6步骤进行检测，确定检测限[17]。检测白菜中毒死蜱浓度为0 mg/kg、0.25 mg/kg时，试纸条呈现阴性结果，浓度为0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1.0 mg/kg时，试纸条呈现阳性结果，即试纸条能够检测出大于等于0.5 mg/kg浓度的毒死蜱白菜样本；检测马铃薯中毒死蜱浓度为0 mg/kg、0.5 mg/kg时，试纸条呈现阴性结果，浓度为1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg时，试纸条呈现阳性结果，即试纸条能够检测出大于等于1.0 mg/kg浓度的毒死蜱马铃薯样本；检测白菜中异菌脲浓度为0 mg/kg、2.5 mg/kg时，试纸条呈现阴性结果，浓度为5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg时，试纸条呈现阳性结果，即试纸条能够检测出大于等于5 mg/kg浓度的异菌脲白菜样本；检测皇冠梨中异菌脲浓度为0 mg/kg、2.5 mg/kg时，试纸条呈现阴性结果，浓度为5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg时，试纸条呈现阳性结果，即试纸条能够检测出大于等于5 mg/kg浓度的异菌脲皇冠梨样本。由此可知，该试纸条的检测限为：毒死蜱检测限为白菜0.5 mg/kg，马铃薯1 mg/kg；白菜和皇冠梨中异菌脲检测限为5 mg/kg，见表1。

表1 毒死蜱、异菌脲二合一试纸条的检测限

注：- 表示阴性，+ 表示阳性。

2.2 特异性

该试纸条检测10 mg/kg的腐霉利、啶虫脒、灭蝇胺等药物，结果均呈阴性，表明该试纸条特异性较好。

2.3 准确性

用试纸条检测50份阴性果蔬样品，检测结果均为阴性，说明假阳性率低于5 %；用试纸条检测50份阳性果蔬样品，试纸条检测结果均为阳性，说明试纸条假阴性率为零，符合《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》要求[17]。

表2 特异性测定

表3 准确性测定

2.4 关于动物饲料方面检测的适用性

由于市场需求，本研究暂时只测定了白菜、马铃薯、皇冠梨等果蔬加工副产品类饲料样本，后续研究会增加样本进行测定。本研究制备的农药残留荧光免疫层析矩阵试纸条，只需根据样本特点调整其前处理方法，即能够检测出该样本的农药残留量，因此，本试纸条对于其他动物饲料方面的检测，同样适用。

3 结论

本文制备出的毒死蜱、异菌脲半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原，最终制备出商品化的荧光免疫层析矩阵试纸条。按照《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》要求，对试纸条进行了特异性、准确性等性能测试，均符合要求。试纸条的检测时间仅为5 min，比现有文献中仪器方法用时更短，操作更简便。试纸条对毒死蜱检测限为叶菜类加工副产品类饲料样本0.5 mg/kg，根茎类加工副产品类饲料样本1 mg/kg；果蔬加工副产品类饲料样本中异菌脲检测限为5 mg/kg，灵敏度较高。该方法作为一种快速筛查手段，可广泛用于果蔬加工副产品类饲料中农药残留的现场筛查和检测，具有重要的经济价值和社会价值。

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（2021–03–24）

S818.9

A

1007-1733（2021）08-0013-06

典型性农残多靶标高效快速检测技术研究与应用（Z181100009318006）项目资助