山东省部分地区牛传染性鼻气管炎抗体的ELISA检测

2021-08-28白明月

山东畜牧兽医 2021年8期

白明月

白明月

（山东省禹城市畜牧业发展中心，山东禹城 251200）

本研究选取济南、泰安、德州、东营、潍坊、临沂等6地15个奶牛场开展流行病学调查，共计获得牛的血清样品1 981份，其中犊牛血清样品489份，成年牛血清样品1 492份，采用ELISA法测定血清样品中的中和抗体，结果显示，14个牛场检测出IBRV gB抗体阳性牛，场阳性率为93.3 %，说明山东省的牛场普遍感染IBRV。进一步分析可知，不同地区、不同牛场、犊牛与成年牛的抗体阳性率差异很大，并无明显相关性。

牛传染性鼻气管炎；牛传染性鼻气管炎病毒；流行病学调查

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotra-cheitis, IBR）又称红鼻病，是由属于I型孢疹病毒（bovine berpesvirus-1，BHV-1）的牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhino-tracheitis Virus，IBRV）引起的一种主要发生在牛的传染病，主要特征是高热、流鼻液，随后发展为呼吸困难等症状，除导致牛生长缓慢、产奶量下降外，亦可造成繁殖力下降、流产等，同时IBRV还可引起免疫抑制，继发其他呼吸道病原，给各国养牛业造成巨大的经济损失[1]。虽然IBR发病后死亡率不高，但由于其可影响国际贸易[2]，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的传染病，我国也将其列为二类动物疫病[3]。该病最早于1955年由Miller在美国科罗拉多的育肥牛群中发现，并于1956年由Madin首次分离出病毒，之后一些学者相继在发病牛的眼结膜、脑、外阴、流产胎儿等组织、材料中分离出病毒。1964年Huck确认IBRV为疱疹病毒。我国于1980年由周泰冲在新西兰进口奶牛中首次分离到IBRV[4]，之后流行病学调查显示IBR在我国广泛流行，严重制约我国养牛业的健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、细胞与血清 IBRV阳性毒株由山东省农业科学院奶牛中心杨宏军研究员馈赠。牛胚肾细胞（MDBK）、IBR阳性血清、阴性血清均购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）。待检血清采集自山东省内的济南、泰安、德州、东营、潍坊、临沂等6市共15个奶牛场或奶牛养殖小区，共计1981份样品。上述牛场未暴发过IBR且均未接种包含IBRV抗原的疫苗。

1.1.2 检测动物 2～6月龄健康奶牛筛选自泰安市及周边养殖场，要求IBRV抗原、抗体均为阴性。IBRV抗原检测时取待检牛的鼻拭子，浸泡于1.0 ml含10 % 胎牛血清的DMEM细胞培养液中，低温运送至实验室，反复冻融3次，8 000 r/min离心10 min，取上清液抽提DNA后直接PCR检测；IBRV抗体检测时无菌采血，析出血清后使用IBRV ELISA抗体检测试剂盒Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus（BHV-1） gB Antibody Test Kit进行检测。

1.1.3 主要试剂及仪器 IBRV ELISA抗体检测试剂盒Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus（BHV-1）gB Antibody Test Kit为IDEXX产品。2×Taq Plus MasterMix（Dye）购于康为世纪生物科技有限公司；低熔点琼脂糖、中性红染色液均为索莱宝公司产品；胎牛血清为Biological Industries（BI）公司产品。

1.2 方法

1.2.1 山东省牛传染性鼻气管炎流行病学调查为了解山东省内IBR的感染情况，本课题组在2016～2018年期间，连同地方畜牧兽医局的春防秋防工作，选取济南、泰安、德州、东营、潍坊、临沂等6地15个奶牛场开展流行病学调查，分别对15个牛场中2～6月龄犊牛和1岁以上成年牛（包括怀孕牛）进行采血，犊牛采血方式为颈静脉采血，成年牛通过尾根静脉采血，共计采血1 981份，其中犊牛采血489份，成年牛采血1 492份。操作时使用10 ml注射器无菌采血5.0 ml，之后将血液负吸到促凝管中，混匀后静置，置于4 ℃ 析出血清后收集到EP管中，56 ℃水浴30 min进行灭活，-20 ℃ 保存待用。15个牛场相关信息见表1。

表1 选取牛场相关信息

1.2.2 ELISA法检测血清样品按Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus（BHV-1）gB Antibody Test Kit说明书进行操作。

2 结果与分析

表2 不同牛场犊牛ELISA法检测抗体阳性率汇总（2016～2018年）

表3 不同牛场成年牛ELISA法检测抗体阳性率汇总（2016～2018年）

将采集的1 981份血清样品全部使用Infec-tious Bovine Rhinotracheitis Virus（BHV-1） gB Antibody Test Kit进行检测，结果显示，济南等6地15个牛场中有14个牛场检测出IBRV gB抗体阳性牛，场阳性率为93.3 %。其中济南、泰安、德州、东营、潍坊、临沂试验牛场的IBRV gB抗体整体平均阳性率分别约为10.2 %、58.0 %、12.4 %、20.3 %、18.5 %和5.0 %。通过数据分析可知，山东省的牛场普遍感染IBRV，但不同牛场的检测结果差异很大，有些牛场，如TA1，犊牛与成年牛抗体检出率都很高，而牛场DZ4的IBRV gB抗体检出率则为0。试验结果显示，不同牛场犊牛、成年牛的抗体检出率并明显相关性。

表4 不同地区ELISA法检测抗体平均阳性率（2016～2018年）

3 讨论

3.1 不同牛场IBRV抗体存在差异的原因

经检测可知，不同牛场IBRV抗体阳性率存在较大差异，部分牛场IBRV抗体检出率高达90 % 以上，部分牛场则未检出，原因之一在于不同牛场采取的管理措施不同[5]，如牛场TA1，未实行自繁自养的模式，主要从东北、内蒙古和浙江等地引牛，犊牛的流动性较大，在引牛的过程中不清楚当地牛场疫病、免疫等情况[6]，加之长途运输，可能导致引进的牛感染了IBRV或是IBRV隐形感染牛，之后配种产犊，由于病毒垂直传播的特性，导致新生犊牛也存在IBRV抗体[7]。反观牛场DZ4，实行自繁自养，近3年中均未检出IBRV抗体阳性牛，说明牛场的管理方式对于疫病的防控会起到关键作用[8]。

3.2 犊牛与成年牛抗体关系的分析

对于自繁自养的牛场，如济南的3个牛场，牛场DZ5、DY2等，新生犊牛全部来源于牛场的怀孕牛，犊牛出生后需饲喂初乳，如果怀孕牛曾经感染过IBRV，体内会产生相应的抗体，并随着初乳被犊牛吸收。初乳在犊牛体内的生物半衰期只有3周左右，但9月龄也能检测到[9]，同时考虑到IBRV垂直传播的特性，体内有IBRV抗体的怀孕牛产犊后的犊牛IBRV抗体检测应为阳性。本研究采集的犊牛与成年牛样品虽然只有部分为母子关系，但抗体阳性率整体符合规律，既怀孕牛IBRV抗体阳性牛产犊后犊牛IBRV抗体也为阳性。而另外部分的牛场，由于经常引进、卖出犊牛，加之引进的犊牛背景不清楚，部分犊牛育成后会配种产犊，导致犊牛与成年牛之间没有明显的IBRV抗体相关性[10]。