柴黄清胰活血方对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺氧化应激的影响

2021-08-28晋小宁姜朝丽刘建琴仁德芳王天刚

西南医科大学学报 2021年4期

晋小宁，姜朝丽，刘建琴，仁德芳，王天刚，李志

1.西南医科大学中西医结合学院（泸州646000）；2.西南医科大学附属中医医院脾胃病科（泸州 646000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）依据其症状、体征及预后的不同可将其分为轻症、中重度及重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）三类[1]。其中，10%～20%的AP 患者可发展为SAP，病死率高达10%～30%，现已成为严重危害我国人民健康以及生命的重大疾病之一[2]。柴黄清胰活血方是由本院脾胃病专家、省名老中医创制，具有清热解毒、泻热通腑、行气止痛、活血化瘀的功效，在本院使用20余年，对重症急性胰腺炎患者疗效显著[1-4]。前期动物实验也证实，柴黄清胰活血方对SAP 模型大鼠具有明显的治疗作用[5-9]，但其作用机制尚不完全明确。本研究旨在通过观察柴黄清胰活血方对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺氧化应激的影响，为其临床应用、医院制剂申报以及新药开发提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康雄性SPF 级SD 大鼠128 只，8 w 龄，体重在220～280 g，购于成都达硕实验动物有限公司。许可证号：SCXK（川）2015-030。动物实验伦理批准号:2019DW113。

1.2 实验药物及剂量

柴黄清胰活血方包括柴胡，黄芩，生大黄，赤芍等，其制剂由西南医科大学附属中医医院制剂室提供。流浸膏生药含量为1.514 g/g。批号:20180602。实验剂量为1.2 g/kg。

1.3 试剂

牛磺胆酸钠：牛黄胆酸钠（公司:sigma，批号:#SLBT9650），戊巴比妥钠（天津兰洪新能源科技公司，批号:170108）。HE染色试剂盒（公司：Solarbio，批号：20191015）、中性树胶（公司：Solarbio，批号：1018X021）。总蛋白（TP）测定试剂盒（公司：南京建成生物工程研究所，批号：A045-2-2）；丙二醛（MDA）测定试剂盒（公司：南京建成生物工程研究所，批号：A003-1-2）；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（公司：南京建成生物工程研究所，批号：A001-1-2）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（公司：南京建成生物工程研究所，批号：A005-1-2）；过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（公司：南京建成生物工程研究所，批号：A007-1-1）。山羊抗小鼠IgG（Bioss，批号:AG05187292），山羊抗兔IgG（CST，批号:27），HO-1（E6Z5G）Rabbit mAb（公司：CST，批号：1#$UNIVPA1907003308-25）。

1.4 仪器

KD-BM 生物组织包埋机（公司：浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）、石蜡切片机（公司：LEI⁃CA，型号：RM2245）、生物显微镜（公司：麦克奥迪实业集团有限公司，型号：BA210LED双目）、正置显微镜（公司：Nikon，型号：ECLIPSE 80i）、凝胶成像系统（公司：Bio-Rad，型号：Universal Hood Ⅱ）。

1.5 动物模型制备与分组

128 只SPF 级雄性SD 大鼠，随机分为4 组，即Blank组、Sham组、SAP组、ChaiHuang组，每组32只。术前适应性喂养1 w，自由进食、饮水，实验前12 h禁食、不禁饮，实验前1 h禁饮。称重，腹腔注射1%戊巴比妥钠（6 μL/g）进行麻醉，固定，备皮，腹部消毒、铺巾，沿剑突下腹中线两侧剪一约2.5～ 3 cm 切口开腹，定位十二指肠，暴露胰胆管，小动脉夹夹闭近肝门处胰胆管，使用磨钝的针头在十二指肠乳头对侧肠壁无血管区刺穿肠壁进入肠腔后退出，用1 mL注射器连接事先的针头，沿预刺的针孔进入肠腔，从十二指肠乳头逆行进入胰胆管，以100 μL/min 速度缓慢推注1 mL/kg 的5%牛磺胆酸钠，同时观察牛磺胆酸钠溶液是否倒流入肠道，注射完成后观察胰腺肿胀、充血情况，取出小动脉夹，逐层关腹，术后禁食、自由饮水。Sham组大鼠开腹后仅翻动十二指肠与胰腺后即关腹。

1.6 灌胃

术后1 h 大鼠苏醒后，Sham 组与SAP 组大鼠灌胃生理盐水（每次10 mL/kg），ChaiHuang组灌胃柴黄清胰活血方（每次1.2 g/kg），每6 h灌胃一次。

1.7 标本采集

各组分别于6，12，24，48 h 取材8 只大鼠，连接血生化管、血常规管采取腹主动脉血；采集每只大鼠相同部位适当大小胰腺组织，新鲜组织立即-80℃冻存，其余组织用10%甲醛固定。

1.8 指标测定

胰腺组织进行HE 染色及病理评分（采用Schmidt 评分法对胰腺组织进行镜下评分，见表1）。血清淀粉酶（AMY）、脂肪酶（LPS）、全血白细胞（WBC）送至西南医科大学附属中医医院检验科检测。取胰腺组织块0.2～1 g，生理盐水漂洗，剪碎组织块，放入离心管中，匀浆，将制备好的10%匀浆液，4 ℃，3 000 rpm/min离心10～15 min，取上清液，按照试剂盒说明测定SOD、GSH-Px、CAT、MDA。Western Blot检测胰腺组织HO-1蛋白的表达。

表1 胰腺组织评分表

1.9 统计学处理

实验数据使用prism7.0 软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，两个及多个样本均数比较采用单因素方差分析（one-way AN0VA），两两比较采用LSD 法，多组比较采用方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色后各组胰腺组织光镜下观察病理改变

Blank 组和Sham 组胰腺组织结构完整，小叶排列整齐，间隔无水肿，叶间隙小叶间隙腺泡间隙正常，无出血、坏死、炎细胞浸润、血管扩张，两组胰腺组织相互比较未见明显差异；与Sham 组相比，6 h SAP 组见叶间隙小叶间隙腺泡间隙明显扩张，有部分腺泡坏死，间隙内及血管周围见明显炎性细胞浸润，12 h SAP 组在6 h 病理改变基础上，有多发片状组织细胞坏死，坏死灶内有大量炎性细胞浸润，24 h SAP在12 h基础上，叶间隙小叶间隙腺泡间隙缩小，细胞坏死减少，仍有大量炎性细胞浸润，48 h SAP组较24 h 叶间隙小叶间隙腺泡间隙明显缩小，偶见少许坏死细胞，有明显炎性细胞浸润；与同时间点SAP组相比，ChaiHuang组相应病理改变明显改善，见图1。

图1 各组大鼠胰腺组织形态结构（HE，× 200）

2.2 各组胰腺组织病理评分比较

与Blank 组相比，Sham 组胰腺组织病理评分无明显差异；与Blank 组、Sham 组相比，SAP 组和Chai⁃huang 组胰腺组织病理评分明显升高（P<0.05）；与SAP 组相比，ChaiHuang 组病理评分明显降低（P <0.05），见表2。

表2 胰腺组织病理学评分（，分）

注：a表示与Sham、Blank比较，P<0.05；b表示与SAP比较，P<0.05

2.3 各组大鼠血清AMY、LPS、全血WBC比较

与Blank 组相比，Sham 组血清AMY、LPS、全血WBC 水平无明显差异；与Blank 组、Sham 组相比，SAP组和ChaiHuang组血清AMY、LPS水平明显升高（P <0.05），6、12、24 h SAP 组和ChaiHuang 全血WBC 水平升高（P<0.05），48 h 无明显差异；与SAP组相比，各ChaiHuang 组血清AMY、LPS 水平明显降低（P <0.05），6、12、24 h ChaiHuang 组血WBC 水平降低（P<0.05），48 h 无明显差异。差异均有统计学意义，见图2、图3、图4。

图2 各组大鼠AMY水平比较

图3 各组大鼠LPS水平比较

图4 各组大鼠WBC水平比较

2.4 各组大鼠胰腺SOD、GSH-Px、CAT、MDA比较

与Blank 组相比，Sham 组SOD、GSH-Px、CAT、MDA 水平未见明显差异；与Blank 组、Sham 组相比，SAP组和ChaiHuang组SOD、CAT水平明显降低（P<0.05），MDA 水平明显升高（P<0.05），SAP 组和12、24 h ChaiHuang 组GSH-Px水平明显降低（P <0.05），6、48 h CharHuang 无明显差异；与模型组相比，柴黄组SOD、GSH-Px、CAT水平较高（P<0.05），MDA水平较低（P<0.05），见图5，图6，图7，图8。

图5 各组大鼠胰腺组织SOD的比较

图6 各组大鼠胰腺组织MDA的比较

图7 各组大鼠胰腺组织GSH-Px的比较

图8 各组大鼠胰腺组织CAT水平的比较

2.5 各组大鼠胰腺组织HO-1表达水平比较

与Blank 组相比，Sham 组HO-1 表达无明显差异；与Sham 组相比，SAP 组和ChaiHuang 组HO-1 水平升高（P <0.05）；与SAP 组相比，ChaiHuang 组6、12、24 h HO-1 水平进一步升高（P <0.05），48 h HO-1水平未见明显差异，见图9，表3。

表3 各组大鼠胰腺组织HO-1水平比较

图9 各组大鼠胰腺组织HO-1水平比较

3 讨论

SAP 发病机制复杂且临床尚未完全明确，目前认为其发病机制包括胰酶自身消化、炎症因子、氧化应激、肠道菌群移位、微循环障碍等[10]。其中，氧化应激是因为体内氧化作用和抗氧化作用之间平衡被打破，产生大量的氧化中间产物，造成氧化损伤。机体内存在两种抗氧化系统：一种是酶抗氧化系统，包括SOD、CAT、GSH-PX 等；另一种是非酶抗氧化系统，包括维生素E、维生素C等[11]。SOD、CAT、GSH-PX为抗氧化物酶，可反应机体抗氧化能力；MDA 是不饱和脂肪酸类物质过氧化反应的终末分解产物，能间接反应氧自由基水平[12]；由于血红素代谢物具有抗氧化、抗凋亡、抗增殖等作用，故HO-1 为一种重要的细胞保护酶[13]，Zhang 等[14]实验证明大鼠SAP 可诱导胰腺HO-1的表达，故提高HO-1表达可减轻氧化应激反应。

柴黄清胰活血方主要由柴胡、黄芩、生大黄、赤芍等14味中药组成，现代药学研究其组成药物可抗炎、抗氧化、止痛、改善循环等作用[15]。赵曙光等[16]研究表明黄芩的主要成分黄芩甙干预能显著抑制SOD活性的下降及降低胰腺组织MDA的含量，可能通过降低胰腺炎的氧化应激水平，减轻胰腺炎症程度而发挥对胰腺炎的保护作用；有学者研究表明大黄的有效成分大黄素具有增加氧自由基清除，抗氧化应激的作用[17]；赤芍的有效成分没食子酸、没食子酸甲酯可清除DPPH 自由基，诱导血红素氧化酶-1 的表达，提高SOD的活性，抑制脂质过氧化反应的作用[18]；厚朴的乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、总生物碱等具有氧自由基清除、抗氧化的作用[19]；丹参的甲醇提取物具有较强的抗氧化活性，水溶性成分可以提高SOD活性，降低MDA水平[20]；枳实的提取物能有效清除氧自由基，具有抑制脂质过氧化作用[21]；以上研究提示上述药物具有抗氧化的作用。本实验结果显示，SAP 组与Sham 组相比，大鼠的血清AMY、LPS、WBC水平较Sham 组明显升高，且AMY、LPS 升高倍数类似于人类急性胰腺炎中重症表现，结合后期胰腺HE染色光镜下观察胰腺组织病理改变，表明SAP 模型大鼠建立成功；ChaiHuang 组与SAP 组相比，Chai⁃Huang 组AMY、LPS、WBC 水平降低，表明柴黄清胰活血方对SAP 具有治疗作用。实验结果表明，Chai⁃Huang 组SOD、GSH-Px、CAT 水平高于SAP 组，MDA水平低于SAP 组，提示柴黄清胰活血方可通过减弱过氧化、增强抗氧化对SAP 模型大鼠胰腺损伤产生保护作用；通过Western Blot方法检测SAP模型大鼠胰腺组织中HO-1表达水平，结果表明ChaiHuang组HO-1水平较SAP组升高，提示柴黄清胰活血方可能通过上调HO-1 水平对SAP 模型大鼠胰腺损伤起到保护作用。