基于药效学实验及响应面法优化复方红景参丸的提取工艺

2021-08-28黄倩，杨燕，刘红，孙琴

西南医科大学学报 2021年4期

黄倩，杨燕，刘红，孙琴

1.西南医科大学药学院（泸州646000）；2.西南医科大学中西结合学院（泸州646000）；3.简阳市人民医院药学部（简阳641400）；4.西南医科大学附属中医医院药物研究中心（泸州 646000）

复方红景参丸源于本院经验方，是以红景天、人参、丹参、麦冬、石斛制成的丸剂，具有益气活血，健脾润肺的功效，临床上可用于预防和改善高原缺氧反应。为将本品开发成具有耐缺氧活性的保健品，本研究在文献检索和预试验研究的基础上，设计了3条工艺路线，并采用耐缺氧试验筛选其活性，对筛选出的工艺路线进一步运用响应面法对红景天、麦冬、石斛3 味饮片的水煎煮工艺进行了优化，现将研究结果报道如下。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器

2030C 3D 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；A560 型双光束紫外分光光度仪（上海翱艺仪器有限公司）；ME155DU/02 型十万分之一电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；ME204E/02 型万分之一电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；101-2A 型电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；BUCHI 旋转蒸发仪（瑞士BUCHI 公司）。

1.2 实验材料

1.2.1 实验试剂红景天苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110818-201708）；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水，其余均为分析纯。

1.2.2 实验药材本实验所涉及药材（见表1），经西南医科大学药学院中医药专家鉴定合格。

表1 实验药材信息表

1.2.3 实验动物SPF级昆明种成年小鼠，西南医科大学实验动物中心提供（SCXK（川）2018-17）。体重为18～22 g，雌性。该动物实验已通过伦理审查。

2 实验方法与结果

2.1 基于药效学实验筛选提取工艺

2.1.1 工艺路线设计由于复方红景参丸的原方在临床上以散剂、汤剂入药，故本研究设计了全方打粉、全方水提2种工艺路线（详见工艺路线1、工艺路线2）。

经查阅文献，君药红景天有健脾补气、润肺活血之功，主要化学成分包括皂苷类、黄酮类、鞣质及挥发油等，其中具有抗缺氧活性的主要成分为红景天苷，极易溶于水，宜采用水提法提取[1-2]。臣药人参，补气健脾，益肺生津，主要化学成分包括皂苷类、多糖类、微量元素及氨基酸等[3-6]，其中具有抗缺氧活性的成分人参皂苷类有醇水两溶性[7-9]。麦冬，养阴润肺生津，主要化学成分为甾体皂苷、高异黄酮、多糖及氨基酸等，麦门冬煎剂、麦门冬水提物、麦门冬注射液皆有提高常压或减压小鼠的耐缺氧能力[10-12]。石斛，可养阴生津益胃，主要含有生物碱类、联苄类、菲类、氨基酸、倍半帖类及多糖类等化学物质[13-17]，传统入药方式多采用水提。使药丹参，活血安神，且其活性成分丹参总酮（脂溶性成分）和丹参总酚酸（水溶性成分）均具有抗缺氧的作用，同时对急性血瘀大鼠血液流变学、血小板聚集和凝血功能具有协同作用，二者配伍使用的效果大于单用效果[18-22]。

综上，红景天、石斛及麦冬的抗缺氧活性成分以水溶性成分为主[23-24]，考虑到人参为贵重药材，丹参易粉碎，且人参、丹参中的耐缺氧活性成分既有水溶性成分又有醇溶性成分，二者打粉入药既可以充分保留活性成分，亦可作为丸剂的赋形剂与崩解剂[25-27]。根据中国药典四部现行版丸剂通则项下规定，供制丸剂用的药粉应为细粉或最细粉，故拟将处方中的人参、丹参饮片粉碎成细粉入药（备用），红景天、石斛、麦冬3 味采用水提（详见工艺路线3），并以红景天苷、总多糖的含量及浸膏得率为评价指标，在单因素试验的基础上，通过多指标综合评分法结合Box-Behnken 设计响应面法优化其水提取工艺，在最大程度上保证抗缺氧药理作用的发挥。

3种工艺路线如下：

工艺路线1：红景天、人参、丹参、麦冬、石斛均直接打粉；

工艺路线2：红景天、人参、丹参、麦冬、石斛均水提；

工艺路线3：红景天、麦冬、石斛水提，人参和丹参打粉。

分别按上述3种工艺路线制备样品，按照《保健食品检验与评价技术规范》2003版“提高缺氧耐受力功能检验方法”项下要求进行“常压缺氧耐受力实验”（将SPF级KM小鼠随机分为空白对照组、方式1组、方式2组及方式3组，在灌胃待测样品提取物1 h后，将小鼠分别置于预先放入5 g钠石灰的磨口锥形瓶中（一瓶一只），瓶盖涂上凡士林，密闭使之不漏气，立即计时，呼吸停止立即停止计时，计算小鼠存活时间。），“急性脑缺血性缺氧实验（将SPF级KM小鼠随机分为空白对照组、方式1组、方式2组及方式3组，在灌胃待测样品提取物1 h 后，对小鼠进行断头处理，小鼠断头后脑部因有残留氧气会张口喘气，自颈部断头立即按秒表计时，停止张口喘气则计时结束。）”，选择常压缺氧小鼠和急性脑缺血性缺氧小鼠的存活时间为评价指标，筛选红景参方的提取路线。结果见表2，给药30 d，三种提取工艺均能不同程度延长小鼠在常压缺氧状态下以及在急性脑缺血性缺氧状态下的存活时间，其中以工艺路线3 制备的样品的抗缺氧活性最为显著。因此，选用红景天、麦冬、石斛水提，人参、丹参打粉作为红景参丸的制备方法。

表2 药物对存活时间的影响（）

注：a表示与空白组比较P<0.05；b表示与空白组比较小鼠的急性脑缺血性缺氧存活时间的P<0.05；c表示与空白组比较小鼠的急性脑缺血性缺氧存活时间的P<0.01

2.2 基于响应面法优化红景天、石斛及麦冬的水提工艺

2.2.1 红景天苷的含量测定

2.2.1.1 溶液的制备红景天苷对照品溶液的制备取红景天苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含1 010 μg 的母液，备用，临用前稀释成所需浓度即得。

2.2.1.2 供试品溶液的制备取干膏提取物粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定重量，超声30 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得。

2.2.1.3 红景天阴性样品取红景天阴性样品（过三号筛）约1 g，按照“供试品溶液的制备”项下制得红景天阴性样品溶液。

2.2.1.4 色谱条件及系统适应性色谱柱为Dr-Maisch C18 色谱柱（46 mm，250 mm，5 μm）；以甲醇-乙腈-水(6∶4∶90）为流动相；检测波长为275 nm；柱温35 ℃；进样量为5 μL；流速1 mL/min。理论板数按红景天苷峰计算大于2 000，拖尾因子，分离度均小于1.5，色谱图，见图1。

图1 红景天苷对照品（A）、样品（B）及阴性样品（C）色谱图

2.2.1.5 线性关系考察取上述1 010 μg/mL的红景天苷对照品母液，稀释成101 μg/mL，分别精密吸取稀释后的红景天苷对照品溶液4，6，8，10，12，14，16 μL，进样，记录色谱图，测定其峰面积。以红景天苷峰面积值（Y）对进样量（X）进行回归，绘制工作曲线，得回归方程为y=342317x-2697.4（R2=0.9999）。以上结果表明，在0.404～1.414 μg 范围内，红景天苷峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.2.1.6 精密度、重复性与稳定性试验①精密度试验精密吸取上述对照品溶液5 μL，进样6 次，测定红景天苷峰面积，计算RSD=0.93%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

②稳定性试验取同一批号供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h进样5 μL，测定峰面积，计算RSD=2.37%（n=6），表明供试品在12 h内稳定。

③重复性试验取已知含量的提取物干膏粉末适量，研细（过三号筛），取6份，按“供试品溶液的制备”项下方法，制备供试品溶液，进样5 μL，测定峰红景天苷面积，计算RSD=2.00%，表明方法的重复性好。

2.2.1.7 加样回收率试验取供试品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，计算红景天苷含量。另取样品溶液适量，加入相同量的对照品，照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，重复6 次，分别计算其加样回收率，平均加样回收率=101.31%，RSD=2.77%。

2.2.2 总多糖的含量测定用苯酚-硫酸法测定总多糖的含量，取无水葡萄糖适量，精密称定，加水制成每1 mL 含102.36 μg 的溶液。精密量取葡萄糖对照品溶液1，2，3，4，5，6 mL 于10 mL 的容量瓶中，加水定容，摇匀。取1 mL 溶液，加1 mL 的5% 苯酚溶液，摇匀，沿试管壁加入5 mL的浓硫酸，室温下放置30 min，在485 nm波长处测其吸光度。以吸光度为纵坐，葡萄糖浓度为横坐标，标绘制标准曲线，计算得到回归方程为y=0.0097x+0.0586（R2=0.9995）。

样品溶液的制备：取制备的提取液250 mL，将其浓缩成25 mL，取1 mL，加无水乙醇使其成90%醇溶液，静置4 ℃过夜，5 000 r/min，离心10 min，用90%醇溶液洗涤2 次，取其沉淀，用水定容至2 000 mL，摇匀，即得。

2.2.3 测定干膏率精密吸取供试品溶液25 mL，用干燥至恒重的蒸发皿在水浴上蒸干溶剂，后于105 ℃烘箱内干燥至重量不在改变，移至干燥器内，冷却30 min，立刻精密称定其质量。以干燥品计算供试品的干膏得率。干膏率（%）=（固形物质量×供试液体积）/（提取饮片的总质量×移取供试液体积）×100%。

2.2.4 单因素实验浸泡时间的考察平行称取复方饮片4份，料液比1∶12，煎煮时间90 min，提取2次的条件下，考察浸泡时间分别为0、30、60、90 min 对红景天苷、总多糖及浸膏得率的综合评分影响。实验表明随着浸泡时间的增加，红景天苷及多糖提取率先增大后减小，但对浸膏得率影响不大，总体呈现先增加后减小的趋势，在30 min达到最佳，后随着浸泡时间的增加。综合评分结果见图2A，随着浸泡时间的增加，缓慢下降，浸泡时间应控制在30～90 min，浸泡时间以60 min为中心点。

提取时间的考察平行称取复方饮片5 份，料液比1∶12，浸泡60 min，提取2 次，考察提取时间分别为30、60、90、120、150 min 对红景天苷、总多糖及浸膏得率综合评分的影响。实验表明，提取时间对红景天苷的提取率影响不大，随着提取时间的增加，总多糖的提取率及浸膏得率先增加后减小。总体来看，结果见图2B，综合评分随着提取时间的增加而增加，当时间为60 min 和90 min 达到最大值，90 min 后缓慢降低。选90 min作中心点。

料液比的考察，平行称取复方饮片5份，浸泡60 min，提取90 min，提取2次，考察料液比分别为1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24对红景天苷、总多糖及浸膏得率综合评分的影响。结果见图2C表明，加水量对综合评分的影响显著，随着加水量的增加综合评分显著增加，在料液比为1∶20 时达到最高后趋于平缓，呈缓慢下降趋势。为节约资源，减少后续干燥成本，选择料液比的范围为1∶12～1∶20，因料液比1∶16处于最佳选择范围，且综合评分较高，故以料液比=1∶16作为响应面法中料液比的中心点。

提取次数的考察平行称取复方饮片3 份，料液比为1∶12，浸泡60 min，提取90 min，考察提取次数分别为1、2、3 次对红景天苷、总多糖及浸膏得率综合评分的影响。结果见图2D。提取1次的综合评分为68.77，提取2次为91.48，提取3次综合评分为99.83。综合评分增长显著，提取3次为99.83对综合评分的影响不大，考虑后续处理工艺，为节约成本提取2 次。

图2 单因素考察结果图

2.2.5 响应面试验

2.2.5.1 响应面试验的设计基于单因素实验的结果，确定提取次数为2 次，把各评价指标的响应值（y）作为响应值，以浸泡时间（A），提取时间（B）和料液比（C）为因子，根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理，选择红景天苷提取率（Y1）、总多糖提取率(Y2）和干膏得率(Y3）的综合评分（Y）（红景天苷提取率、总多糖提取率、干膏得率权重系数分别为0.5、0.3、0.2）为响应值，使用Design-Expert 8.0.6 软件和Box-Behnken 设计了响应面试验。具体因素和水平情况见表3，实验设计及结果见表4。

表3 响应面试验的因素与水平表

表4 响应面试验的方案及结果表

2.2.5.2 拟合模型与显著性检验应用Design-Ex⁃pert 8.0.6软件对表3中的数据进行建模分析，获得了具有综合评分（Y）的浸泡时间（A），提取时间（B）和料液比（C）的多元回归方程：y=94.79-0.7A（2.500E-003）B+3.81C+1.18AB+1.77AC-1.77AC-1.73BC-0.79A2-2.69B2-4.23C2。据表4，P<0.05，R2=0.9204故说明模型已达到显著水平，且试验结果受试验因素影响的可能性为92.04%。另失拟项的P 值为0.1286，大于0.05，则试验不存在明显失拟因素。因此，用该回归方程分析和预测最佳提取工艺是可靠的。回归方程各项分析中F 检验可以判断自变量对因变量的影响，由此得到各因素对响应值的影响程度为C（加水量）>A（浸泡时间）>B（提取时间）。

2.2.5.3 响应面试验结果分析根据回归模型，绘制相应的等高线和响应面图，检验响应面的形状，分析各测试因素对评价指标综合得分的影响（图3，图4）。相互作用的大小可以通过轮廓的形状反映出来，如果是椭圆形的，这意味着两个因素的相互作用是显著的，如果是圆形的，则相反。通过对三组图表的比较可以看出，提取时间和料液比之间的相互作用对综合得分的影响最为明显。三维图形的表面较陡峭，提取时间与浸泡时间的交互作用对综合评分影响不大。图表的表面更平滑。通过Design-Expert 8.0.6 软件对模型进行求解，得到红景天、麦冬及石斛的最佳水提工艺参数∶浸泡时间59.07 min，提取时间85.21 min，加料液比1∶17.90，回流提取2 次。考虑实际生产的可操作性，浸泡时间60 min，提取时间85 min，加水量为18倍，回流提取2次。

图3 各因素对综合评分影响的响应面图

图4 各因素对综合评分影响的等高线图

2.3 验证试验

取红景天、麦冬、石斛饮片三批，根据最佳工艺条件，即浸泡时间60 min，提取时间85 min，提取2次，加水量为18倍。测定红景天苷提取率、总多糖提取率和干膏率，分别为5.82（mg/g），253.50（mg/g），44.79%，综合得分为99.82。三批样品各指标成分RSD均小于2.0%，表明优选的提取工艺稳定可行。

表5 回归方程方差分析

3 讨论

化学药品成分简单且明确，在对其工艺路线进行研究时，通常以一两个成分的理化性质为指标来考察并确定某一工艺路线。而中药制剂成分复杂，采用单一指标确定其工艺路线不能充分发挥中医药的多组份多靶标的优势。如若采用药效学指标和成分指标相结合的方式来优化制备工艺路线，将使活性成分的提取更具有目的性、有效性和准确性。

本研究通过查阅文献并结合原处方的临床给药方式制定出3 条工艺路线，以常压缺氧小鼠和急性脑缺血性缺氧小鼠的存活时间为评价指标，以药效学实验评价提取工艺路线，结果显示三种工艺制备的样品均能不同程度延长小鼠在常压缺氧状态下以及在急性脑缺血性缺氧状态下的存活时间，其中以红景天、麦冬、石斛水提，人参和丹参打粉制备的样品抗缺氧活性最为显著。

目前，通过正交实验来优化提取工艺较为常见，但正交试验是基于线性模型的，而在实际情况下，目标响应值与因素之间的关系不一定是线性关系，非线性拟合最适用的方法为响应面法。本实验用单因素结合响应面法来优化红景天、麦冬、石斛3味饮片的最佳水提工艺，得到最佳水提取工艺参数为∶加浸泡时间60 min，提取时间85 min，提取2次，加水量为18倍。该提取工艺稳定，重复性好，为将红景参方开发成具有提高缺氧耐受活性的保健品奠定了基础。