氨基酸发酵尾液菌体蛋白的高效提取

徐太海，赵兰坤，孙钦波，王小平，刘世周，李紫璇

（1．大庆师范学院，黑龙江 大庆 163712；2．黑龙江省油田应用化学与技术重点实验室，黑龙江 大庆 163712；3．呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司，内蒙古 呼伦贝尔 162650）

氨基酸生产企业提取了必要的氨基酸后，产生大量的发酵尾液，氨基酸废水直接排放会严重污染环境，如何经济有效地处理尾液是众多氨基酸生产厂家所面临的重要问题[1]。发酵尾液中含有大量的菌体蛋白等营养物质，菌体蛋白占氨基酸废水中有机成分的30%~40%。如果可以高效回收废液中的谷氨酸菌体蛋白，不仅可以物尽其用，还可减轻对环境的污染[2]。

目前，氨基酸尾液中菌体蛋白的提取主要有以下几种方法。碟片分离技术主要是使用碟片分离机来分离混合物质[3]，转鼓内有一组互相套叠在一起的碟形零件——碟片[4]，碟片可提高沉降速度[5]。超滤法主要是指利用半透膜的微孔结构，在一定外界压力的作用下，使水中的一些物质透过膜，从而实现对物质的选择性分离、回收的膜分离方法。体积相对膜表面微孔径较大的物质会被截留下来成为浓缩液，从而实现提取的目的[6]。膜分离技术除了能分离固体的溶质以外，也可以对溶液中溶解的气体进行分离[7]，常用的超滤膜种类有聚砜膜等[8]。超滤法单位体积内有效膜面积较小、膜要求较高，一般需要做在无纺布上以增加其机械性能[9]。絮凝沉淀法在提取浓缩液中加入絮凝沉淀剂以吸附架桥和电中和方式与蛋白果胶等发生分子间相互作用，使之沉降，除去溶液中的粗粒子已达到分离的效果[10]。由于碟片分离法其耗能高，超滤法的成本较高，很少在大型工厂使用，因此絮凝沉淀法去除菌体蛋白是目前大多数工厂选择的方式。废水中含有的有机化合物是厌氧微生物、兼性厌氧菌等需要处理的主要对象[11]。厌氧微生物将工业废水中的有机物转变成无机物以及少量细胞物质[12]。由于厌氧生物技术对环境条件有着较高要求，单独厌氧生物技术处理工业废水还难以有效推广，应积极与其他工艺技术结合起来应用[13]。

综上所述，絮凝沉淀法是最常用的菌体蛋白提取方法，工业上大多数使用聚丙烯酸钠。合成有机高分子絮凝剂具有用量小、絮凝能力强、沉淀速度快等优点，在水处理领域具有广阔的应用前景[14]。影响絮凝沉淀效果的因素有很多，如pH值过高或过低都会影响菌体蛋白的提取[15]，过高或过低的旋转速度也会使絮凝效果受到一定的影响[16]。本研究主要是对絮凝沉淀法的3个影响因素进行探索，通过改变其热维持时间、加热温度以及搅拌时间3个因素条件，检测其蛋白收率，确定提取菌体蛋白的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

谷氨酸高浓度尾液由呼伦贝尔东北阜丰生物科技有限公司提供。

试验所用仪器见表1。

表1 试验仪器Tab.1 Experimental apparatus

1.2 试验方法

从车间提取发酵尾液正常生产时物料的pH值3.0~4.0，调节来水料液与储存罐料液的pH值应该在3.0~4.5之间，对存储罐里高段浓污和低段浓污进行调节，主要是为了调节pH值，防止pH值过高或过低；另外还要检查用药量情况。将化药罐温度控制在40~60℃，提取菌体蛋白时要控制喷射器的温度在40~60℃[17]。单因素试验设计如下：

（1）热维持时间。

将加热维持时间分为5、10、15、20、25 min，观察上清液的透光度及其在10 min内过滤液的体积，并记录数据。

（2）加热温度。

控制菌体蛋白的温度分别为40、45、50、55、60℃，在絮凝剂的浓度为2‰下进行，温度梯度差为5℃的试验。观察菌体变性絮凝效果，记录数据。

（3）搅拌时间。

在温度控制在50℃，絮凝剂浓度控制在2‰的条件下，分别使搅拌时间为3、6、9、12、15 min进行絮凝沉淀，观察菌体变性絮凝效果，记录数据。

将处理后的发酵尾液进行过滤，将湿蛋白放入烘箱内进行烘干，等待测量计算。

计算蛋白回收率，以每个单因素的最适水平左右两侧各选一水平并记录[18]，菌体蛋白回收率计算公式如下：

菌体蛋白收率=干菌体重量/发酵废液中菌体蛋白重量×100% （1）

将记录好的数据整理后进行整体分析，再结合单因素试验结果，进行L9（34）正交试验，选择最优组合。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 热维持时间对菌体蛋白分离和过滤效果的影响（见表2）

由表2可知，随着加热时间的逐渐延长，上清液的透光度及其过滤的效果越好。在20 min时，虽然上清液的透光度依旧上升，但是其过滤体积有很明显的下降趋势；在25 min时，上清液透光度和过滤体积均有所下降。过滤体积越大说明有越多的菌体蛋白絮凝沉淀。过滤体积变小，说明菌体蛋白呈流动絮状，有可能是加热时间过长，使原本已经形成的絮凝团溶解开，与水溶液混合在一起，无法形成絮凝团，水与流动状态的菌体蛋白难以分离，因此过滤出来的体积少。由此可知，加热时间在15 min时，上清液的澄清度及其过滤效果最好。因此，取其左右两边水平分别为10、15、20 min进行正交试验。

表2 热维持时间对菌体蛋白分离和过滤效果的影响Tab.2 Influence of heat maintenance time on isolation and filtration effect of thallus protein

2.1.2 加热温度对菌体蛋白分离的影响（见表3）

由表3可知，在固定絮凝剂的浓度为2‰下，当温度为40、45℃时，絮凝体积松散，絮凝效果差。当提取菌体蛋白的温度达到50、55、60℃时，絮凝效果开始有明显变化，絮凝团开始变得大且结实，絮凝效果好，蛋白收率分别为7.54、7.32及6.93 g/L。由此可知，加热温度在50℃时，絮凝效果最好，取其左右两边水平分别为45、50、55℃进行正交试验。

表3 加热温度对菌体蛋白分离的影响Tab.3 Influence of heating temperature on isolation of thallus protein

2.1.3 搅拌时间对菌体蛋白分离的影响（见表4）

由表4可知，随着搅拌时间的逐渐延长，絮凝体积开始逐渐由松散变得结实，絮凝团由小变大，蛋白提取率也逐渐增大。但是，当搅拌时间达到12 min时，絮凝体积开始变得松散，絮凝效果差，絮凝团开始由大变小，蛋白提取率也开始下降。由此可知，搅拌时间在9 min的时候菌体变性絮凝状况最好，蛋白收率也最高。因此，取其左右两边的水平分别为6、9、12 min进行正交试验。

表4 搅拌时间对菌体蛋白分离的影响Tab.4 Influence of stirring time on isolation of thallus protein

2.2 正交试验结果（见表5、表6）

表5 菌体蛋白提取的因素与水平Tab.5 Factors and levels of bacterial protein extraction

表6 菌体蛋白提取影响因素的正交试验结果Tab.6 Orthogonal test results of factors affecting bacterial protein extraction

由表6可知，各组试验结果数据相差不大，蛋白提取率最大为7.29 g/L，最小为6.86 g/L，故选择极差分析法。影响蛋白收率的因素主次顺序为：热维持时间、搅拌时间、加热温度（温度过低的絮凝效果较差，超过45℃直到55℃，絮凝效果变化不大甚至有所降低）。试验得出的优水平为A2B1C3，但是从表中可以看出，C3与C2相差很小。综合企业实际情况以及对能源节约的方面考虑选择C2，从而可以得出最优组合是A2B1C2。

3 结论

当热维持时间15 min、加热温度45℃、搅拌时间9 min时，菌体蛋白的收率最高。