骨肉瘤细胞外泌体调控JAK2/STAT3信号通路影响成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化*

折胜利 宋兴华 周杨 何园 贾晶 刘彦博 王良华

(1.西北工业大学医院骨科，陕西 西安 710012；2.新疆医科大学第一附属医院骨病/骨肿瘤科，新疆 乌鲁木齐 830054；3.陕西省新安中心医院骨科，陕西 西安 710048；4.新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

骨肉瘤是常见的骨原发性恶性肿瘤，多发病于青少年，表现为成骨细胞分化并产生恶性类骨质，具有易转移、易复发、侵袭性高等特点，容易发生远端转移[1-2]。骨肉瘤的治疗主要是根治性肿瘤切除和新辅助化疗的结合，虽然新辅助化疗能够对骨肉瘤起到明显的治疗效果，但是治疗后患者的生存率低于20%[3-5]，所以研究更多用于骨肉瘤治疗的靶点对于其临床治疗至关重要。

外泌体是一类由多数活细胞分泌的纳米级囊泡，粒径约50～100 nm，内含多种RNA、蛋白质、脂质等物质，可随体液转移至靶组织和靶器官而发挥调控作用[6-7]。研究表明，肿瘤细胞分泌的外泌体可携带肿瘤细胞的遗传物质，而调控肿瘤细胞的生长、转移、血管新生、免疫逃逸等过程[8-10]。已有研究表明，肝癌细胞外泌体可调控肿瘤相关成纤维细胞的激活而促进肿瘤的转移[9]，但骨肉瘤细胞外泌体是否具有此作用尚无明确报道。本研究通过骨肉瘤细胞外泌体对成纤维细胞转化的影响，旨在为骨肉瘤的临床治疗和研究提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63，人成骨细胞hFoB1.19(中科院上海细胞库)；人肺成纤维细胞MRC-5(普诺赛生物技术有限公司)；cDNA合成试剂盒、qRT-PCR试剂盒(福麦斯生物技术有限公司)，p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、GAPDH(武汉三鹰生物技术有限公司)，Transwell小室(福麦斯生物技术有限公司)，无外泌体胎牛血清(爱必信生物科技有限公司)。

1.2 细胞培养 U2-OS、MG-63、hFoB1.19细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，MRC-5细胞培养于含10%胎牛血清及1%非必需氨基酸的MEM培养基中，所有细胞均在37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养至细胞汇合率达70%～80%时，使用胰蛋白酶溶液消化并传代，取对数生长期的细胞进行后续研究。

1.3 外泌体的提取 差速离心法提取hFoB1.19、U2-OS、MG-63细胞外泌体，具体步骤为：将细胞接种至细胞培养皿中，用含10%无外泌体胎牛血清的DMEM培养基培养48 h后收集细胞培养上清，然后将上清液3000×g，4 ℃离心15 min；收集上清液6000×g离心40 min；收集上清液10000×g离心1 h，取上清；100000×g离心1 h，收集沉淀即为外泌体，用400 μL PBS重悬外泌体，并放在-80 ℃保存。

1.4 外泌体的鉴定 透射电镜观察外泌体的结构，主要步骤为：取透射电镜专用的铜网，滴加20 μL外泌体溶液，使用红外灯烘烤铜网10 min，继续向铜网滴加2滴磷钨酸，继续使用红外灯下烘烤10 min，用滤纸吸取多余的液体，在透射电镜下拍照，并观察外泌体的结构。

1.5 细胞增殖 将MRC-5细胞稀释至50000个/mL，将上述细胞接种至96孔板，每孔100 μL，每组3个复孔，每孔加入外泌体，使外泌体终浓度为10 μg/mL，在培养箱中共孵育，分别于24、48、72 h取出对应的细胞培养板，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于培养箱中孵育4 h后，使用酶标仪检测各孔450 nm处的吸光度，OD值越大，细胞增殖能力越强。

1.6 细胞迁移 用DMEM空白培养基重悬MRC-5细胞，细胞接种至Transwell小室中，每孔1×104个细胞，体积为200 μL，每孔加入外泌体，使其终浓度为10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μL DMEM完全培养基，然后将24孔板置于细胞培养箱中24 h，Transwell小室底部用结晶紫染色10 min，然后在显微镜下观察并拍照，比较各组细胞迁移数。

1.7 细胞侵袭 用Transwell小室法检测细胞侵袭能力，主要步骤为：取Matrigel胶融化后，20 μL平铺于Transwell小室中，小室置于37 ℃培养箱中1 h，使Matrigel胶充分凝固，用DMEM空白培养基重悬MRC-5细胞，细胞接种至Transwell小室中，每孔1×104个细胞，体积为200 μL，每孔加入外泌体，使其终浓度为10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μL DMEM完全培养基，然后将24孔板置于细胞培养箱中24 h，Transwell小室底部用结晶紫染色10 min，然后在显微镜下观察并拍照，比较各组细胞侵袭数。

1.8 qRT-PCR 将MRC-5细胞接种于6孔板中，每孔加入外泌体，使其终浓度为10 μg/mL，共孵育24 h后，使用TRIzol试剂盒提取各组细胞的RNA，使用核酸定量仪定量后，根据cDNA试剂盒将RNA逆转录为cDNA，然后使用qRT-PCR试剂盒进行反应，以GAPDH为内参，使用2-△△CT法计算基因相对表达量。所用引物序列见表1。

表1 IL-1β、IL-6、 IL-8、GAPDH引物序列

1.9 Western blot 取与外泌体共孵育24 h后的MRC-5细胞1×107个消化于离心管中，使用RIPA蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒定量，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，每孔上样量为10 μg，转膜，用5%BSA封闭2 h，然后以1∶1000比例稀释后的一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应半分钟，曝光并拍照，用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

2 结果

2.1 外泌体鉴定结果 透射电镜鉴定外泌体结果显示，差速离心法提取到的外泌体具有双层膜结构，形态呈“杯托”样，粒径约为50～100 nm，符合外泌体的形态特征，见图1。Western blot检测外泌体标志结果显示，差速离心法提取到的外泌体表达外泌体标志蛋白TSG101、HSP70、CD63、CD9，符合外泌体生物学特征，可用于后续研究，见图2。

图1 透射电镜观察外泌体形态结果

图2 Western blot检测外泌体标志蛋白结果

2.2 骨肉瘤外泌体促进MRC-5细胞增殖能力 CCK8检测骨肉瘤外泌体对MRC-5细胞增殖能力，结果显示，与PBS组相比，hFoB1.19 exo组细胞的增殖能力无显著变化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo组MRC-5细胞增殖能力显著增加(P<0.01)，说明骨肉瘤外泌体能够显著促进MRC-5细胞的增殖能力，见图3。

图3 CCK8法检测骨肉瘤外泌体对MRC-5细胞增殖能力的影响

2.3 骨肉瘤外泌体促进MRC-5细胞迁移能力 Transwell小室法检测细胞迁移结果显示，与PBS组相比，hFoB1.19 exo组细胞迁移数无显著变化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo组MRC-5细胞迁移数目显著高于PBS组(P<0.001)，说明U2-OS exo和MG-63 exo组MRC-5细胞迁移能力显著增加，提示骨肉瘤外泌体可显著促进MRC-5细胞迁移能力，见图4。

图4 Transwell小室法检测骨肉瘤外泌体对细胞迁移能力影响结果(20×)

2.4 骨肉瘤外泌体促进MRC-5细胞侵袭能力 细胞侵袭实验检测骨肉瘤外泌体对MRC-5细胞侵袭能力，结果显示，与PBS组相比，hFoB1.19 exo组细胞侵袭数无显著变化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo组MRC-5细胞侵袭能力显著增加(P<0.001)，提示骨肉瘤外泌体可显著促进MRC-5细胞侵袭能力，见图5。

图5 细胞侵袭实验检测骨肉瘤外泌体对细胞侵袭能力影响结果(20×)

2.5 骨肉瘤外泌体促进MRC-5细胞IL-1β、IL-6、IL-8表达 QRT-PCR检测与外泌体共孵育后MRC-5细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8表达，结果显示，与hFoB1.19细胞外泌体共孵育后，MRC-5细胞中IL-1β、IL-6、IL-8的表达与PBS组相比无显著差异(P>0.05)，

与U2-OS和MG-63细胞分泌的外泌体共孵育后，MRC-5细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8表达显著增加(P<0.001)，说明骨肉瘤外泌体能够促进成纤维细胞中炎症因子的表达，即骨肉瘤外泌体促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化，见图6。

图6 qRT-PCR检测骨肉瘤细胞外泌体对MRC-5细胞中炎症因子表达的影响

2.6 骨肉瘤外泌体促进MRC-5细胞α-SMA、Vimentin、FAP表达 Western blot检测骨肉瘤外泌体对MRC-5细胞α-SMA、Vimentin、FAP表达的影响，结果显示，与PBS组相比，hFoB1.19 exo组MRC-5细胞α-SMA、Vimentin、FAP表达无显著变化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo组MRC-5细胞α-SMA、Vimentin、FAP表达显著增加(P<0.001)，见图7。α-SMA、Vimentin、FAP是肿瘤相关成纤维细胞标志蛋白，说明骨肉瘤外泌体能够促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化。

图7 Western blot检测骨肉瘤外泌体对MRC-5细胞α-SMA、Vimentin、FAP表达的影响

2.7 骨肉瘤外泌体激活JAK2/STAT3信号通路 Western blot检测骨肉瘤外泌体对MRC-5细胞JAK2/STAT3信号通路的影响，结果(图8)显示，相比于PBS组，hFoB1.19 exo组MRC-5细胞JAK-2和STAT3磷酸化水平无显著变化(P>0.05)，U2-OS exo和MG-63 exo组MRC-5细胞JAK-2和STAT3磷酸化水平显著增加(P<0.001)，说明骨肉瘤外泌体能够显著激活MRC-5细胞JAK2/STAT3信号通路，提示骨肉瘤外泌体能够激活JAK2/STAT3信号通路而促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化。

图8 Western blot检测骨肉瘤外泌体对JAK2/STAT3信号通路激活的影响

3 讨论

肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境中的重要组成部分，在肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用。研究表明，肿瘤相关成纤维细胞并非独立存在，而是伴随在肿瘤微环境中，调控肿瘤的生长与存活，并且可维持肿瘤的恶性倾向[11]。而大多数的肿瘤相关成纤维细胞是由局部组织固有的成纤维细胞转化而来，肿瘤相关成纤维细胞的转化受肿瘤微环境调控[12-14]。肿瘤细胞可将外泌体分泌至肿瘤微环境，并且可通过外泌体将肿瘤自身的遗传信息转移至肿瘤微环境中的其他细胞，进而促进肿瘤的发生、发展[15-16]。研究表明，肿瘤相关成纤维细胞的激活受肿瘤外泌体的调控[17-18]，如肺癌细胞外泌体可通过激活NF-κB信号通路促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化，肝癌细胞亦通过外泌体促进肿瘤相关成纤维细胞的转化，进而促进肿瘤的转移。本研究主要探讨了骨肉瘤外泌体对肿瘤相关成纤维细胞转化的影响。

本研究发现，将骨肉瘤细胞分泌的外泌体和成骨细胞分泌的外泌体分别与成纤维细胞共孵育后，骨肉瘤细胞外泌体能够显著促进成纤维细胞增殖、迁移和侵袭能力，而成骨细胞外泌体则无此功能，说明骨肉瘤细胞外泌体具有调控成纤维细胞的功能。

肿瘤相关成纤维细胞可通过分泌IL-1β、IL-6、IL-8而调控肿瘤微环境中的免疫反应。α-SMA、Vimentin、FAP是表达于肿瘤相关成纤维细胞中的标志蛋白。为了探讨骨肉瘤细胞外泌体是否能调控成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化，将外泌体分别与成纤维细胞共孵育后检测成纤维细胞IL-1β、IL-6、IL-8的表达和α-SMA、Vimentin、FAP的表达，结果显示，骨肉瘤细胞外泌体可显著上调成纤维细胞中IL-1β、IL-6、IL-8的表达和标志蛋白α-SMA、Vimentin、FAP的表达，这说明骨肉瘤外泌体可促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化。

JAK/STAT信号通路是众多细胞因子信号转导的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程，JAK2蛋白的激活触发STAT3的磷酸化。磷酸化的STAT3二聚化并转移至细胞核，然后与靶基因分子结合并激活特定的基因翻译[19-22]。JAK/STAT信号通路的激活可促进肿瘤相关成纤维细胞的激活，进而促进黑色素瘤血管新生。本研究发现，骨肉瘤细胞外泌体可促进成纤维细胞中JAK和STAT的磷酸化，即激活JAK/STAT信号通路。

4 结论

骨肉瘤细胞外泌体能够通过激活JAK/STAT信号通路，促进成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞的转化，但外泌体中何种物质发挥作用，还需进一步研究。