大蒜素复配保鲜剂对大口黑鲈保鲜效果的影响

许 萍，黄 敏，廖 涛，熊光权，张金木，王炬光，耿胜荣，白 婵，*

(1.湖北省农业科学院 农产品加工与核农技术研究所/湖北省农产品辐照工程技术研究中心，湖北 武汉 430064；2.四川省原子能研究院 辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都 610101)

大口黑鲈(Micropterussalmoides)，黑鲈属，营养丰富，已逐渐成为最受大众欢迎的鱼种类之一[1]。然而，生鲜鲈鱼容易腐败变质，难以满足日益增长的大众需求，严重制约了相关产业的发展。因此，开发有效的鲈鱼保鲜技术，延长贮藏时间并保证其品质已成为水产品保鲜领域的重要研究方向之一。

生物保鲜剂尤其是含有天然、无毒的植物提取成分的保鲜剂近年来进入大众视野。大蒜素(allicin，AL)对多种细菌、真菌、病毒具有杀灭或抑制作用，且安全无毒、来源充足[2]。茶多酚(tea polyphenol，TP)是茶叶中多酚类物质及其衍生物的总称，是较为常见的天然保鲜剂品种之一。葡萄籽提取物(grape seed extract，GSE)具有抗氧化、抗疲劳和抗菌等生物活性，在食品、药品与化妆品等领域得到了广泛应用。适宜的植物提取成分之间存在抗菌性的协同增效作用。若将多种具有不同效能的保鲜剂复配用于水产品保鲜，充分发挥每种保鲜剂优势的同时，可以降低浓度，扩大杀菌范围，提高防腐效果[3]。Hassanzade等[4]研究了壳聚糖和GSE复配对虹鳟鱼片在4 ℃贮存下的保鲜效果，含有GSE的壳聚糖更有助于保持鱼片的感官品质，并延长了货架期。官爱艳等[5]研究发现：竹叶抗氧化物、茶多酚和乳酸链球菌素复配对海鲈鱼肉有较好的保鲜效果，货架期较对照组延长了6 d。然而，关于大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物三者复配作为鲈鱼贮藏保鲜剂，及其保鲜作用的研究却鲜有报道。

本研究将大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物3种天然植物提取成分复配后用于鲈鱼保鲜，以菌落总数、汁液流失率、硫代巴比妥酸反应物(TBARS)值、pH值、挥发性盐基氮(TVB-N)值、感官评价及肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力为指标进行鲈鱼冷藏货架期的品质分析，以期通过效能互补、协同保鲜，探究复配保鲜剂保鲜效果，旨在为开发以植物提取物为原料的鲈鱼复配保鲜剂提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大口黑鲈(统称鲈鱼)，购自湖北省武汉市武商量贩超市，挑选健康、大小一致，体重约450 g，体长约28 cm的鲈鱼作为实验原料。大蒜素(纯度20%)，实验室自主方法提取[6]；茶多酚、葡萄籽提取物(食品级，纯度均为98%，粉末状)，西安汇林生物科技有限公司；平板计数琼脂培养基、生化试剂，青岛海博生物技术有限公司；氯化钠、三氯乙酸、氯仿、硫代巴比妥酸、盐酸、无水碳酸钠、氧化镁、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、体积分数95%乙醇，中国医药(集团)上海化学试剂有限公司；超微量Ca2+-ATPase测试盒，南京建成生物工程研究所。如无特殊说明，所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

YM 50型立式压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司；THZ-98B型恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司；HF safe-1200 A2型生物安全柜，香港力康公司；HH-S6型恒温水浴锅，郑州杜甫仪器厂；UH5300型紫外可见分光光度计，日本日立公司；3K15型台式高速冷冻离心机，美国Sigma公司；GB-1000型全自动真空包装机，康贝特食品包装器械有限公司；SPARK型酶标仪，瑞士TECAN 仪器公司；FE20型pH计，武汉永盛科技有限公司；K9860型全自动凯氏定氮仪，济南海能仪器公司。

1.3 实验方法

1.3.1复配保鲜剂的配制

准确称取不同质量的大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物，用无菌蒸馏水配制质量分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的大蒜素、茶多酚、葡萄籽提取物保鲜剂，所有生物保鲜剂均贮存于4 ℃冰箱中预冷备用。鲈鱼复配保鲜剂配方质量分数按如下工艺确定：进行3种保鲜剂配比的单因素实验和响应面试验，设置大蒜素、茶多酚、葡萄籽提取物质量分数为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%进行单因素实验，分别在贮藏第 0、3、6、9、12天检测鲈鱼菌落总数、TBARS值和汁液流失率，最终选定0.2%、0.3%、0.4%作为大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物的低、中、高水平，并以贮存9 d鲈鱼的 TBARS 值为响应值，进行三因素三水平响应面试验，对复配保鲜剂配方进行优化，优化复配比为0.40%大蒜素、0.32%茶多酚和0.34%葡萄籽提取物，此工艺下得到的鲈鱼TBARS值最低。控制环境温度低于10 ℃，按优化复配比用无菌蒸馏水配制复配保鲜剂，所有复配保鲜剂均贮存于4 ℃冰箱中预冷备用。

1.3.2鲈鱼样品处理

将购买的鲜活鲈鱼装在有冰块的泡沫箱内于30 min内运至实验室。控制环境温度低于10 ℃，将购买的鲈鱼立即宰杀，去头、尾、鳞、内脏，沿脊骨将鱼肉剖成2片，揭去鱼皮，取背部鱼肉切成约4.0 cm×4.0 cm×1.0 cm的鱼块，用预先煮沸冷却及紫外杀菌后的冷蒸馏水清洗干净，滤纸吸取表面的水分。大蒜素处理组(AL组)、大蒜素复配保鲜剂处理组(AL+TP+GSE组)为鱼块随机放入预冷的大蒜素、大蒜素复配保鲜剂中并浸泡30 min，对照组为放入预冷的蒸馏水中同样浸泡30 min。将浸泡完成的鱼块取出，并于放置了无菌纱布的双层沥水篮上沥干，分装于高温蒸煮袋中真空包装，贮存于4 ℃冰箱中。每3 d进行1次取样，对分别贮藏0、3、6、9、12、15 d时鲈鱼的菌落总数、汁液流失率、TBARS值、pH值、TVB-N值和肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力、感官评分进行测定。

1.3.3菌落总数的测定

参照GB/T 4789.2—2016《食品微生物学检测菌落总数的测定》进行[7]。在超净工作台中，采用梯度稀释法，首先称取10 g剪碎的鱼肉样品于90 mL无菌生理盐水中，混合均匀，此为第一梯度稀释，依次每次从上一梯度溶液中移取1 mL加入到9 mL无菌生理盐水中，涡旋混匀。取15～20 mL琼脂培养基于培养皿中，再分别在每一梯度的溶液中取出1 mL加入培养皿中，轻晃均匀，水平放置。待琼脂培养基完全凝固后，倒置于培养箱中，在(30±1)℃条件下，按照水产品培养(72±3)h的要求进行培养，每个梯度重复实验3次，按照国标进行菌落总数计数，单位为CFU/g。

1.3.4汁液流失率的测定

分别称量经过不同保鲜剂处理的完整包装样品的质量(m1)；打开包装袋，将包装袋内的汁液倒出，将鱼肉表面及袋内残留的汁液用吸水纸吸干，称量包装袋和鱼肉总质量(m2)；包装袋单独称重(m3)。汁液流失率按式(1)计算。

(1)

1.3.5硫代巴比妥酸反应物的测定

在Zhu等[8]的方法上进行一定改进测量脂质氧化产生的次级产物TBARS。取5 g鱼肉样品，剪碎，加入3 mL体积分数7.5% 三氯乙酸、体积分数0.1%酸丙酯、质量分数0.1%EDTA混合溶液后均质，真空过滤。取2.5 mL滤液与相同体积的0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸混合后在90 ℃下加热30 min，冷却至室温。取5 mL上清液，加入5 mL氯仿，于2 000 r/min下离心10 min，测定上清液在532 nm的吸光度，TBARS值以1 kg肌肉样品中所含丙二醛的毫克数表示，mg/kg。TBARS值计算见式(2)。

(2)

式(2)中，A532，上清液在532 nm下的吸光度；m，鱼肉样品质量，g；9.24，由样品稀释和摩尔消光系数得到的常数。

1.3.6pH值的测定

称取10 g碎鱼肉于具塞三角瓶中，加入100 mL蒸馏水，混合均匀，控制环境温度20 ℃，静置30 min后，离心，过滤，取上清液50 mL，用pH计进行测定。

1.3.7挥发性盐基氮的测定

参照GB/T 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》进行[9]。

1.3.8肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力的测定

称取鲈鱼鱼肉10 g，剪碎，加入90 mL 4 ℃的生理盐水，冰水浴条件下匀浆后，在4 ℃下离心20 min (2 500 r/min)。取上清液用4 ℃的生理盐水稀释成质量分数1%组织匀浆，按Ca2+-ATPase测定试剂盒说明书进行测定，单位为U/mg。

1.3.9感官评价

感官评价小组由6名成员组成，所有成员在感官培训前，均先熟悉了鲈鱼的感官特征。以鲈鱼的颜色、气味、肌肉弹性和肌肉组织状态为评分对象，进行感官评价，采用5分制进行评估：非常理想为5分，可取的为4分，可以接受的为3分，无法接受的为2分，非常不能接受为1分。总感官评分20分，12分为不能接受的界限[10]。

1.4 数据处理

每个实验设3次重复，取平均值。采用Origin 8.5软件进行图形绘制，采用SAS 8.1 软件进行方差分析，显著性水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 复配保鲜剂对鲈鱼菌落总数的影响

微生物是造成水产品腐败的主要因素之一，菌落总数能反映腐败的程度。保鲜剂处理后鲈鱼菌落总数变化见图1。由图1可知，鲈鱼初始菌落总数为3.57 lg(CFU/g)，这与之前的报道类似[11]，表明鲈鱼贮藏初期质量良好。随着贮藏时间的延长，对照组在第9天时，菌落总数已经超过新鲜鱼片菌落总数可接受限度值7 lg(CFU/g)[12]；而大蒜素处理组和复配保鲜剂处理组均符合水产品食用标准。当贮藏到第12天时，经大蒜素处理的鲈鱼菌落总数为7.08 lg(CFU/g)，达到了贮藏终点；而经过复配保鲜剂处理的鲈鱼，其菌落总数为6.25 lg(CFU/g)，直到贮藏第15天，其菌落总数为7.04 lg(CFU/g)，达到贮藏终点。因此，对照组货架期约为9 d，经大蒜素处理的鲈鱼货架期约为12 d；而经复配保鲜剂处理的鲈鱼，其货架期达到了15 d，较对照组约延长了6 d。大蒜素处理可以明显抑制微生物的生长，大蒜素分子中的氧原子可与细菌繁殖时所需的半胱氨酸或各种酶的巯基发生化学反应，使细菌体内重要氧化反应不能正常进行，从而使病菌致死，具有较好的抑菌作用。茶多酚也可与细菌体内酶结合使之失活从而达到抑菌的作用。大蒜素、茶多酚和GSE的复配进一步产生协同抑菌效果，降低菌落总数，延长了鲈鱼货架期，可作为鲈鱼保鲜的绿色保鲜剂。

图1 不同保鲜剂处理对鲈鱼菌落总数的影响Fig.1 Effects of different preservative treatments on total viable count of weevers

2.2 复配保鲜剂对鲈鱼汁液流失率的影响

水产品在贮藏过程中会产生一定的汁液流失，这是由于微生物繁殖使得肌肉组织细胞分解，产生汁液[13]。同时产生的汁液也为微生物生长提供了可能，加速了水产品的腐败和营养成分的流失。保鲜处理后4 ℃下贮藏的鲈鱼汁液流失率的变化见图2。由图2中可知，整个贮藏期，汁液流失率随着贮藏时间的延长而逐渐增大。在贮藏初期，经过大蒜素和复配保鲜剂处理的鲈鱼，汁液流失率略高于对照组，这是由于保鲜剂处理使得肌肉组织表面暂时失去了平衡；但在后续贮藏中，这2种处理鲈鱼的方式均使得汁液流失率显著低于对照组(P<0.05)。贮藏末期，大蒜素处理组汁液流失率较对照组低了3.85%，复配保鲜剂处理组汁液流失率较对照组低11.77%，这表明复配保鲜剂的加入可以延缓汁液流失，较好地保证产品质量。这可能是因为保鲜剂使微生物的生长受到抑制，从而减缓了鲈鱼肌肉组织分解、蛋白质变性和降解的速率，维持了肌肉组织的致密性，使得产品保持良好的平衡。

图2 不同保鲜剂处理对鲈鱼汁液流失率的影响Fig.2 Effects of different preservative treatments on juice loss rate of weevers

2.3 复配保鲜剂对鲈鱼硫代巴比妥酸反应物的影响

在水产品贮藏过程中，脂质易氧化生成不稳定的氢过氧化物，并进一步分解出次级产物，TBARS值表示脂质氧化形成次级产物的程度，可作为水产品脂肪氧化程度的评价指标[14]。一般当水产品肌肉TBARS值达到1.0～2.0 mg/kg时，脂质氧化生成的醛类和酮类小分子产生的恶臭味道已经使水产品失去了食用价值[15]。鲈鱼贮藏期间TBARS值见图3，贮藏初期为0.24～0.35 mg/kg。随着贮藏时间的增加，各组鲈鱼样品的TBARS值均呈现上升趋势。对照组的TBARS值由最初的0.35 mg/kg上升到贮藏第15天的1.48 mg/kg。贮藏的15 d内，大蒜素处理组、复配保鲜剂处理组的TBARS值均显著低于对照组(P<0.05)。在贮藏第15天时，大蒜素处理组的TBARS值为1.20 mg/kg，而复配保鲜剂处理组的TBARS值为0.84 mg/kg。表明大蒜素对延缓鲈鱼脂质氧化具有一定的效果，而复配保鲜剂则对延缓鲈鱼TBARS值升高的效果更好。茶多酚和GSE作为肉类保鲜剂时均具有强抗氧化性，从而使得复配保鲜剂能有效延缓脂肪氧化。复配保鲜剂可作为鲈鱼保鲜剂，在延缓鲈鱼脂肪氧化中优于单独使用大蒜素保鲜剂。

图3 不同保鲜剂处理对鲈鱼硫代巴比妥酸反应物的影响Fig.3 Effects of different preservative treatments on TBARS value of weevers

2.4 复配保鲜剂对鲈鱼pH值的影响

水产品的腐败与pH值的变化紧密相关，而pH值与鱼宰杀后肌肉变化过程有关，鲜鱼宰杀后肌肉的正常pH值一般在6～7[16]。保鲜处理后，鲈鱼pH值变化见图4。对照组、大蒜素处理组和复配保鲜剂处理组的初始pH值分别为6.94、6.90和6.83。随着贮藏时间的延长，各组鲈鱼pH值均呈现先下降后上升的趋势。贮藏初期的下降可能是由于在鱼的僵死阶段，厌氧糖酵解过程产生了丙酮酸，进而产生并积累了乳酸；而后期的增加可能是由于微生物和内源酶的作用，造成了生物胺和氨等碱性化合物的积累[17]。在整个贮藏期，与对照组相比，复配保鲜剂处理组使鲈鱼的pH值显著降低(P<0.05)，pH值上升的趋势也更为平缓；而大蒜素处理组与对照组无明显差异(P>0.05)。说明复配保鲜剂中茶多酚和GSE在维持鱼肉pH值稳定方面起主要作用，而三者协同作用后对由微生物引起的碱性化合物的增加有明显抑制作用，较单独的大蒜素处理更有效。

图4 不同保鲜剂处理对鲈鱼pH值的影响Fig.4 Effects of different preservative treatments on pH value of weevers

2.5 复配保鲜剂对鲈鱼挥发性盐基氮的影响

TVB-N主要是由微生物作用引起的肌肉蛋白及非蛋白含氮化合物的分解产生的，由三甲胺、二甲胺、氨以及其他含氮化合物组成，是判断鱼肉腐败程度的重要指标[18]，一般认为鱼肉的TVB-N值可接受范围应低于25 mg/100 g[19]。贮藏期间，鲈鱼TVB-N值的变化见图5。本研究中，TVB-N值随着贮藏时间延长不断增加。在整个贮藏周期(15 d)，大蒜素处理组和复配保鲜剂处理组的TVB-N值均显著低于对照组(P<0.05)，复配保鲜剂组TVB-N值最低，增速最慢。对照组在贮藏第9天时达到24.7 mg/100 g，接近可接受范围的最大值；而大蒜素处理组在第12 天达到26.0 mg/100 g，复配保鲜剂组在第15天达到25.9 mg/100 g，超出可接受值。这可能是由于大蒜素及茶多酚、GSE处理造成细菌总数的快速减少，降低了细菌对非蛋白类的含氮化合物的氧化去氨基能力。单独的大蒜素处理可以抑制微生物生长，并在一定时间内减少鲈鱼鱼肉中蛋白质降解，但与茶多酚和GSE复配后可以更有效抑制微生物生长，从而延长鲈鱼货架期，减缓贮藏过程中TVB-N值的上升速率。Feng等[18]发现茶多酚复合臭氧水处理黑鲷比单独处理可以更有效地抑制微生物，与本研究得到的结果类似。

图5 不同保鲜剂处理对鲈鱼挥发性盐基氮的影响Fig.5 Effects of different preservative treatments on TVB-N value of weevers

2.6 复配保鲜剂对鲈鱼肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力的影响

肌原纤维蛋白的完整性可用ATP 酶的活力来评价，Ca2+-ATPase活力越高，肌原纤维蛋白的完整性越好[20]。Ca2+-ATPase活力变化见图6。由图6可知，在贮藏初期，肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力为2.04 U/mg；随着贮藏时间的延长，对照组和处理组肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力均有所下降。与贮藏初期相比，贮藏15 d后，对照组和大蒜素处理组酶活力分别下降59.9%和47.6%；而复配保鲜剂组下降38.0%。整个贮藏期间，对照组Ca2+-ATPase活力显著低于大蒜素处理组和复配保鲜剂组(P<0.05)。这可能是与鲈鱼死后肌肉发生鱼体僵直、自溶及腐败变质等复杂理化变化有关。Ca2+-ATPase 活力下降的原因是肌原纤维蛋白中巯基被氧化，形成二硫键导致分子聚合，也可能是肌球蛋白头部的构象变化及聚合导致Ca2+-ATPase 活力下降。本研究表明：经过大蒜素和复配保鲜剂处理后的鲈鱼，肌原纤维蛋白的完整性被破坏的速率减慢，且蛋白完整性始终高于对照组。大蒜素具有较强的抑菌性，结合茶多酚和GSE的强抗氧化性，降低了微生物对鱼肉氢键的破坏力，维护了蛋白质的稳定性，延缓了Ca2+-ATPase活力的下降[21]。

图6 不同保鲜剂处理对鲈鱼Ca2+-ATPase活力的影响Fig.6 Effects of different preservative treatments on Ca2+-ATPase activity of weevers

2.7 复配保鲜剂对鲈鱼感官评价的影响

感官评价是判断鱼体是否腐败的一个重要指标[22]。感官评价主要对鲈鱼的颜色、气味、肌肉弹性和肌肉组织状态进行评价(图7)，可接受的最低限度为12分。由图7可知，在第0天时，对照组和处理组鲈鱼样本感官评分均较高，品质优良。在低温条件下，随着贮藏时间的延长，所有鲈鱼样品的品质均显著下降。对照组在贮藏9 d时，感官评分为11.50分，已经低于品质要求的最低限度，判定其不可再食用；而此时，大蒜素处理组和复配保鲜剂处理组感官评分分别为13.00分和15.17分，仍然满足食用要求。大蒜素处理组和复配保鲜剂处理组感官评分分别在第12天和第15天低于品质要求最低限度。因此，大蒜素处理组和复配保鲜剂处理组均能有效保持鲈鱼品质，且货架期分别延长3 d和6 d，与菌落总数变化分析、TVB-N值分析得出的结果一致。

图7 不同保鲜剂处理对鲈鱼感官评价的影响Fig.7 Effects of different preservative treatments on sensory evaluation of weevers

3 结 论

结合冷藏期间大口黑鲈鱼肉各化学指标(pH值、TVB-N值)、菌落总数、感官指标(气味、色泽、组织状态和肌肉弹性)、脂质氧化指标(TBARS值)、肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力分析，大蒜素及大蒜素复配保鲜剂(大蒜素、茶多酚和葡萄籽提取物复配)作为鲈鱼保鲜剂具有良好的保鲜作用，能够有效抑制冷藏鲈鱼鱼肉中微生物的生长繁殖、鱼肉脂质氧化和腐败变质，延缓了鲈鱼贮藏过程中汁液流失、TVB-N值的上升，更好地保持了鲈鱼蛋白质结构的稳定性，使肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力下降减缓；而3种保鲜剂复配在鲈鱼保鲜中具有协同增效作用，较单一大蒜素处理具有更好地保鲜效果。大蒜素单一处理及3种保鲜剂复配处理与对照组相比分别可以延长鲈鱼货架期3 d与6 d。3种保鲜剂安全、无毒、易得，在水产品保鲜领域具有较为广阔的应用前景。