牡蛎酶解物对慢性不可预知温和应激斑马鱼抑郁行为改善作用研究

陈贝贝，彭志兰，章超桦,2，*，林海生,2，高加龙,2，郑惠娜,2，曹文红,2，秦小明,2

(1.广东海洋大学 食品科技学院/国家贝类加工技术研发分中心(湛江)/广东省水产品加工与安全重点实验室/广东省海洋生物制品工程实验室/水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088；2.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034)

牡蛎(Crassostreahongkongensis)，广泛分布于中国广东、广西等南部海域，富含蛋白质、糖原和牛磺酸等多种营养物质，有“海中牛奶”之称[1]。牡蛎具有独特的保健功能和药用价值，《神农本草经》和《海药本草》等记载,牡蛎具有重镇安神、去烦热等功效[2]；另外，柴胡加龙骨牡蛎汤具有抗抑郁作用，且效果显著。抑郁症是多发于各个年龄层的常见神经疾病。近年来，越来越多的研究表明，抑郁症的发生和发展与脑内神经炎症和氧化损伤相关[3]。有研究证明，牡蛎肉水提液可以改善脑部氧化应激和脑衰老，提高大脑海马区大锥体细胞数，提高脑部超氧化物歧化酶含量，降低丙二醛含量[4]；此外，牡蛎提取物对体外培养的神经干细胞也具有保护作用[5]。已有研究表明，牡蛎酶解产物具有抗氧化、抗炎、调节免疫、抗疲劳、抗衰老[6-9]等活性，然而，目前关于牡蛎是否能够改善抑郁的相关研究较少，因此，牡蛎酶解产物是否具有抗抑郁作用有待进一步探究。

斑马鱼作为新型模式生物，具有成本低、用药量少等多种优点[10]，可以高通量地进行活性物质筛选；同时，斑马鱼与人类有高达70%以上基因同源性[11]，并且有类似的中枢神经系统(central nervous system，CNS)形态[12-14]，作为实验动物用于神经行为学和神经内分泌学研究具备很大的潜力[15-16]。目前，国外对斑马鱼在神经方面的研究较为完善，国内关于斑马鱼相关研究较少，并且主要集中在利用斑马鱼进行药物毒性筛选，并未对其进行有效的开发利用。为了探究牡蛎酶解产物的抗抑郁作用及其潜在机理，本研究选用成年斑马鱼作为实验动物，建立慢性不可预测温和应激诱导的斑马鱼抑郁样模型，拟通过药物暴露方式补充牡蛎酶解产物，采用新颖环境测试和光暗箱等行为学测试评价牡蛎酶解产物干预对斑马鱼抑郁行为的改善作用；计算斑马鱼体重指数，测定斑马鱼外周组织中糖皮质激素水平以及大脑中炎症因子(TNF-α、IL-1β)、抗炎因子IL-10和神经营养因子等表达水平，进而研究牡蛎酶解产物潜在的抗抑郁机理，希望为牡蛎酶解产物抗抑郁活性物质的开发以及活性成分的筛选提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3～5个月月龄成年野生型近交短尾斑马鱼(雄雌比例约为1∶1)，购自上海乙诺水族科技有限公司，并安置在小型鱼饲养设施中，实验室环境安静。

1.2 材料与试剂

新鲜香港牡蛎，购于广东省湛江市东风市场。香港牡蛎广泛分布于中国广东、广西等南部海域，是南海重要经济贝类，因此，本实验选用香港牡蛎作为实验原料。

动物蛋白酶，广西南宁庞博生物工程有限公司，酶活力为3×105U/g；氟西汀，常州四药制药有限公司；E112-01/02，BCA蛋白含量试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；斑马鱼脑神经营养因子(BDNF)试剂盒、斑马鱼皮质醇(CORT)ELISA 试剂盒、斑马鱼白细胞介素1β(IL-1β)ELISA 试剂盒、斑马鱼肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA 试剂盒、斑马鱼白细胞介素10(IL-10)ELISA 试剂盒，江苏酶免实业有限公司。

1.3 仪器与设备

Lynx 6000型高速冷冻离心机、Varioskan Flash型多功能酶标仪，Thermo Scientific 公司；R-1005型旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；FDU-1100型真空冷冻干燥机，日本东京理化器械株式会社；SHZ-B型水浴恒温振荡器，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；手工匀浆器。

1.4 实验方法

1.4.1牡蛎酶解物制备

牡蛎酶解物(oyster hydrolysates，OHs)，参照李婉等[17]的方法制备并稍加改进。将牡蛎肉与3倍体积的蒸馏水(g:L)进行匀浆，调节pH值至7.0，加酶量1 000 U/g，于53 ℃水浴恒温振荡器中酶解5 h，100 ℃沸水浴灭酶10 min，迅速冷却至室温后离心。在4 ℃下以8 000 r/min离心20 min，过滤去除杂质，取上清液进行浓缩，经冷冻干燥后得OHs。

1.4.2实验动物分组及给药方法

斑马鱼以每组15条鱼饲养在6 L带有过滤装置和供氧装置的小水箱里，水箱中水温 (25±2)℃,pH值7.0～7.4，溶解氧量(8.5±1.2)mg/L，12 h循环光暗交替。斑马鱼每日投喂饲料2次(上午8点，下午6点)，每次投喂量1.5 g/kg，饲养至少14 d以适应实验室环境(饲养条件及饲料投喂量参考文献[18-19])。斑马鱼给药剂量参考文献[20]中的急性毒性预实验：将斑马鱼分别浸泡在100、200、400、800、1 600 mg/L牡蛎酶解液中，1 h后发现800、1 600 mg/L组斑马鱼头部有红斑，100、200、400 mg/L组斑马鱼头部无红斑，确定斑马鱼最大耐受剂量为600 mg/L；将最大耐受剂量作为高剂量组，并依次3倍递减浓度确定中剂量组和高剂量组给药浓度。斑马鱼具体分组及给药剂量情况见表1。在整个实验过程中，空白对照组不作任何应激及药物处理，用药组在应激的第4周开始给药，每天上午8:30喂食后给药，给药完成后对其进行应激处理。给药方式为：将给药组的斑马鱼分别捞出至相应药物浓度的1.5 L塑料容器中(容器中装有0.5 L相应浓度的药物)，药物暴露30 min，给药方式参考文献[21]。

表1 实验动物分组及给药剂量Tab.1 Grouping of experimental animals and dosages

1.4.3斑马鱼抑郁模型构建与行为学实验

1)实验造模。选用慢性不可预知温和应激斑马鱼抑郁模型。慢性不可预知温和应激抑郁动物模型目前应用较为广泛，该模型与抑郁症发病过程具有高度的相似性。主要通过捕食者暴露、食物剥夺、黑暗处理、拥挤环境等应激项目对斑马鱼造成不可预知的慢性应激。应激流程参考Song等[21]35 d斑马鱼慢性不可预知模型，并稍加改动，第25天的应激项目更换为黑暗处理。

2)行为学实验。参考Egan等[22]新颖环境实验(NTT)和Cachat等[23]光暗箱实验(LDB)，记录斑马鱼在测试模型中的行为，进而分析斑马鱼抑郁样行为是否得到改善。在实验的第36天，上午9点至下午2点之间，对斑马鱼进行行为学测试。

NTT行为学测试:将预处理的斑马鱼随着其生活水缓慢倒入梯形测试水槽中，用高清摄像头记录斑马鱼在水槽中上部停留时间(在水槽上部所有停留时间)，记录时长为5 min。NTT行为学设备为一个1.5 L梯形水箱(高度15 cm×顶部长度28 cm×底部长度23 cm×宽度7 cm)，将梯形水箱最大程度装满水，并通过线条在设备外部标记为两个相等的虚拟水平。

LDB行为学测试:将预处理的斑马鱼随着其生活水缓慢从黑暗区倒入光暗箱中，用高清摄像头记录斑马鱼在光暗箱中的黑暗区潜伏期(从黑暗处第一次来到光亮处前持续时间)和在光亮处停留时间，记录时长5 min。LDB行为学设备为一个12 L矩形水箱(高度20 cm×长度30 cm×宽度20 cm)，以中线为界限，一半采用无光线黑暗遮光处理。

行为学测试结束后，以冰浴的方式牺牲动物，并记录每条斑马鱼体重及体长。在冰面快速解剖斑马鱼，解剖头部取脑。将组织标本过液氮后迅速放于-80 ℃保存，避免反复冻融。

1.4.4外周组织中皮质醇含量测定

取出鱼身组织，按质量(g)与体积(mL)比为1∶9的比例加入9倍体积的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。用手工匀浆器将标本匀浆充分，离心20 min(3 000 r/min)，仔细收集上清液并分装。测定鱼身组织蛋白浓度，具体实验操作参考BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行。参考斑马鱼皮质醇ELISA试剂盒说明书，测定外周组织中皮质醇含量。

1.4.5鱼脑组织炎症相关细胞因子含量测定

鱼脑样本处理方式同1.4.4。采用斑马鱼TNF-α、IL-1β和IL-10 ELISA试剂盒测定鱼脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量，具体操作参照说明书。

1.4.6鱼脑组织脑神经营养因子含量测定

鱼脑样本处理方式同1.4.4。采用斑马鱼神经营养因子ELISA试剂盒测定鱼脑中神经营养因子的含量，具体操作参照说明书。

1.5 数据处理

实验结果均以平均值±标准差表示，所有数据采用JMP Pro13软件进行统计学分析，采用Origin 2017和Excel等软件制图。对数据进行组间差异性显著分析，采用最小二乘均值Studentt检验判断组间差异。所有分析中，组间差异显著以P<0.05表示，组间差异极显著以P<0.01表示。

2 结果与分析

2.1 牡蛎酶解产物对斑马鱼抑郁样行为的影响

慢性不可预测应激的小鼠和大鼠抑郁样模型是目前抑郁症研究领域使用最广泛的模型，近年来对斑马鱼也建立了相应的慢性应激抑郁样模型[21,24-25]。目前对斑马鱼抑郁样行为的测定主要采取NTT和LDB两个行为学测定实验。斑马鱼进入陌生的新环境，需要一个探索和适应的过程。在NTT测试中，把斑马鱼放进新环境测试水槽中时，大部分斑马鱼会游到水槽底部或者角落，直到它们适应周围环境，才会开始试探性地慢慢扩大游动范围向上部游动；在新环境中，斑马鱼在上部停留时间与鱼的紧张焦虑程度呈负相关。在LDB测试中，把斑马鱼放进光暗箱中时，大部分斑马鱼会偏好光线比较弱的地方，直到它们适应周围环境，才会慢慢从黑暗区游出开始向光亮区游动。在新环境中，斑马鱼在光亮区停留时间与鱼的紧张焦虑程度呈负相关，游出黑暗处所需的时间(也就是在黑暗区潜伏期)和鱼的紧张焦虑程度呈正相关。在NTT和LDB行为学实验中，每组选取12条斑马鱼，进行行为学观察，得到实验结果。

通过NTT行为学实验得到图1。由图1可知，与空白组相比，应激模型组(斑马鱼在上部停留时间极显著减少，此现象与Egan等[22]新颖环境测试实验结果相似，说明应激组斑马鱼出现了明显的焦虑行为；与应激模型组相比，阳性对照组斑马鱼在上部停留时间极显著增加，说明阳性药物氟西汀对缓解斑马鱼焦虑行为有很好的效果；同时，与应激模型组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组斑马鱼在上部停留时间均有不同程度的显著增加，说明低、中、高浓度的牡蛎酶解物对斑马鱼焦虑行为有明显改善。伴随着牡蛎酶解物给药剂量的增加，斑马鱼在上部停留时间先上升后下降，中剂量组斑马鱼在上部停留时间最长，其改善斑马鱼在NTT行为学实验中焦虑行为效果最好。

#表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)；*表示与应激模型组相比差异显著(P<0.05)，**表示与应激模型组相比差异极显著(P<0.01)。图1 牡蛎酶解物对NTT实验中斑马鱼行为的影响Fig.1 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish behavior in NTT experiment

通过LDB行为学实验得到图2。由图2(a)可知：与空白组相比，应激模型组斑马鱼在黑暗区潜伏期时间极显著增加，由图2(b)可知，应激模型组在光亮区停留时间显著减少，此现象与Cachat等[23]光暗箱测试实验结果相似，说明模型组的斑马鱼行为焦虑程度明显高于空白组；与应激模型组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组斑马鱼在光亮区停留时间均有不同程度的显著增加，在黑暗区潜伏期均有不同程度的减小，中剂量组在黑暗区潜伏期最短而且在光亮区停留时间最长，均表现出明显的改善焦虑行为的作用，说明中剂量组改善斑马鱼在光暗箱中焦虑行为效果最佳。

#表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)；*表示与应激模型组相比差异显著(P<0.05)，**表示与应激模型组相比差异极显著(P<0.01)。图2 牡蛎酶解物对LDB实验中斑马鱼行为的影响Fig.2 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish behavior in LDB experiment

由图1和图2可知，在一定药物剂量范围内，随着药物浓度增高，斑马鱼抑郁行为改善效果越明显，具有一定的剂量依赖性。中剂量组牡蛎酶解物在NTT和LDB行为学实验中均对斑马鱼焦虑行为改善效果最好，反而过高的药物剂量对斑马鱼焦虑行为并没有更好的改善。这个现象可能是因为高浓度的牡蛎酶解物溶液本身腥味过大，而斑马鱼嗅觉十分敏感[26]，太腥的气味容易对斑马鱼造成一定的应激。Oliveira等[27]研究中发现，斑马鱼暴露于死亡物种的气味中也会表现出防御状态，且皮质醇含量上升，而长期的高水平皮质醇会进一步刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴，致其功能失调，进而导致大脑海马受到损伤。另一种可能是，浓缩食品提取物的暴露会改变水质参数(如pH值或渗透压)，从而进一步间接给斑马鱼带来压力。因此，牡蛎酶解物高剂量组可能不是最佳给药剂量组，具体原因需要在后续实验中进一步探究。

2.2 牡蛎酶解产物对斑马鱼体重指数的影响

经历慢性不可预知温和应激的动物体重会显著下降[28]，体重和体重指数(BMI)都是反映机体胖瘦的评判标准，体重指数是目前最常用的一个评判标准，同时也是衡量鱼类胖瘦程度的非常重要的指标[29]。Dreimüller等[29]研究发现，在抗抑郁治疗反应过程中，伴随患者抑郁程度的降低，患者BMI有升高的现象。本研究采用斑马鱼体重(g)与体长(cm2)的平方之比[30],来计算BMI。由斑马鱼BMI得图3，由图3可知：与空白组相比，应激模型组斑马鱼体重指数极显著下降；与应激模型组相比，阳性对照组斑马鱼体重指数极显著上升，说明阳性药物对改善应激后斑马鱼体重指数下降有很好的效果；与应激模型组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组斑马鱼体重指数均有不同程度的显著增加，说明低、中、高浓度的牡蛎酶解物对斑马鱼体重下降均有明显的改善，中剂量组改善斑马鱼体重下降效果最好。

2.3 牡蛎酶解产物对斑马鱼外周组织皮质醇含量的影响

#表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)；*表示与应激模型组相比差异显著(P<0.05)，**表示与应激模型组相比差异极显著(P<0.01)。图3 牡蛎酶解物对斑马鱼体重指数的影响Fig.3 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish body mass index

皮质醇是一种糖皮质激素。机体分泌过多的皮质醇会导致神经细胞被损坏，抑制正常的下丘脑-垂体-肾上腺轴负反馈机制；过高水平的皮质醇进而过度刺激大脑海马皮质醇受体，使海马正常功能受到损伤，并导致海马5-羟色胺和去甲肾上腺素缺乏症，影响行为认知功能，这些变化与抑郁症患者脑部神经中枢变化的观察结果一致[31]。斑马鱼外周组织皮质醇含量测定结果见图4，由图4可知：与空白组相比，应激模型组斑马鱼鱼身组织内皮质醇的含量显著增加；与应激模型组相比，阳性组、低剂量组、中剂量组和高剂量组使用药物之后，显著减少了慢性不可预知温和应激诱导的斑马鱼皮质醇含量的增加。这种现象说明，牡蛎酶解物降低了斑马鱼的皮质醇含量，有助于调节皮质醇对下丘脑-垂体-肾上腺轴的负反馈以及减少对海马的损害，进而改善抑郁状态。中剂量组降低斑马鱼皮质醇在鱼身中表达的效果最好。

2.4 牡蛎酶解产物对斑马鱼脑部炎症相关细胞因子的影响

#表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)；*表示与应激模型组相比差异显著(P<0.05)，**表示与应激模型组相比差异极显著(P<0.01)。图4 牡蛎酶解物对斑马鱼外周皮质醇含量的影响Fig.4 Effect of oyster hydrolysates on peripheral cortisol content of zebrafish

细胞因子是免疫细胞分泌的生物活性蛋白，它们是细胞之间的信息传递者，有协调免疫反应,参与神经化学和调节神经内分泌的作用。胶质细胞可被视为脑内特化的免疫细胞，主要由小胶质细胞(BV2)产生。当BV2受到应激时，被激活的BV2可表现为两种状态，M1型BV2主要分泌致炎因子，M2型BV2分泌抗炎因子及神经营养因子。

TNF-α和IL-1β是炎症细胞因子的重要成员，他们的表达水平与抑郁程度呈正相关。TNF-α和IL-1β可激活NF-κB和JNK等信号通路，进而促进炎症因子的表达和细胞凋亡，同时它们能促进下丘脑释放促肾上腺皮质激素，最终导致肾上腺皮质分泌更多的糖皮质激素，破坏下丘脑-垂体-肾上腺轴的正常调节机制，并进一步导致糖皮质激素水平上升、海马受损，这些现象与抑郁症的发病有关。斑马鱼脑组织TNF-α和IL-1β的含量测定结果见表2。由表2可知：与空白组相比，应激模型组经应激后，斑马鱼脑内TNF-α的含量极显著增加，IL-1β的含量显著增加；与应激模型组相比，使用低剂量组、中剂量组和高剂量组牡蛎酶解物之后，显著减少了慢性不可预知温和应激诱导的斑马鱼脑部TNF-α含量的增加，中剂量组降低斑马鱼TNF-α脑内含量效果最为显著；给药后斑马鱼脑部IL-1β含量也不同程度的降低，由表2知，中剂量组降低IL-1β脑内含量效果最好，但无显著性差异。本研究表明，低、中、高浓度的牡蛎酶解物能通过改变斑马鱼脑部的组织炎症因子含量来改善斑马鱼抑郁样行为，其中中剂量组降低斑马鱼脑部炎症因子含量效果最好，尤其是对TNF-α含量的降低起了很重要的作用。

表2 牡蛎酶解物对斑马鱼脑部致炎因子含量的影响Tab.2 Effect of oyster hydrolysates on contents of inflammatory factors in brain of zebrafish pg/mg

IL-10作为一种重要的抗炎和免疫调节细胞因子，能够通过激活JAK1/STAT3信号通路下调Bax表达、上调Bcl-2表达，抑制神经元细胞凋亡，从而发挥强大的神经保护作用。IL-10还能抑制小胶质细胞生成促炎症因子,从而降低星形胶质细胞的反应性,促进星形胶质细胞分泌TGF-β,减弱了小胶质细胞的活化[32]。斑马鱼脑组织IL-10的含量测定结果见图5。由图5可知：与空白组相比，应激模型组经应激后，脑内IL-10水平极显著高于空白组；酶解物低剂量组和中剂量组脑内IL-10 含量高于应激组，但无显著差异，这可能是由于成年斑马鱼有很强的神经修复能力。Zhang等[33]对损伤诱导的成年斑马鱼脑再生进行长期体内监测，发现斑马鱼大脑组织在损伤后的第43天完全恢复，这说明斑马鱼在接收到应激带来的损伤时，能迅速进行自我修复，这一现象与Song等[21]实验中得到的应激后脑内IL-10含量较空白组升高的研究结果相似。

#表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)。图5 牡蛎酶解物对斑马鱼脑部抗炎因子IL-10含量影响Fig.5 Effect of oyster hydrolysates on contents of anti-inflammatory factors IL-10 in brain of zebrafish

2.5 牡蛎酶解物对斑马鱼脑部神经营养因子的影响

#表示与空白对照组相比差异显著(P<0.05)，##表示与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)。图6 牡蛎酶解物对斑马鱼脑部神经营养因子含量的影响Fig.6 Effect of oyster hydrolysates on BDNF content in zebrafish brain

神经营养因子是一类对神经元提供营养支持的蛋白质，可促进神经元的生长和分化，影响神经网络的形成和神经元的可塑性。斑马鱼脑部神经营养因子含量测定结果见图6。由图6可知：与空白组相比，应激模型组经过应激后，斑马鱼脑部神经营养因子含量显著升高(P<0.05)，这与斑马鱼较强的神经自我修复能力有关，这一现象与Song等[21]发现的斑马鱼应激后脑内神经营养因子含量较空白组升高的研究结果相似；与应激模型组相比，中剂量组增加了斑马鱼脑部神经营养因子含量，但无显著性差异；与阳性组相比，使用低剂量组、中剂量组牡蛎酶解物之后，均不同程度地增加了斑马鱼脑部神经营养因子含量，其增加效果不显著。

3 结 论

经过慢性不可预知温和应激之后，斑马鱼在行为学测试中的表现为探索行为降低，趋暗行为增强，焦虑程度增加；斑马鱼体重指数降低；斑马鱼组织中的炎症因子和皮质醇水平升高。

经过牡蛎酶解产物的给药后，与应激模型组相比，低、中、高剂量组牡蛎酶解产物给药组的斑马鱼探索能力增强，表现为在上部停留时间升高；趋暗行为减弱，表现为在黑暗区潜伏期明显缩短，在光亮区停留时间明显升高，说明斑马鱼抑郁样行为得到改善；斑马鱼体重指数明显升高，外周组织皮质醇水平明显降低，且脑组织中的炎症因子如TNF-α水平也明显降低，说明牡蛎酶解产物可以降低斑马鱼组织中的TNF-α和皮质醇的水平，抑制炎症反应，从而达到改善抑郁的作用。本研究发现，牡蛎酶解产物可以通过调节皮质醇水平以及抑制慢性不可预知温和应激诱导的炎症反应来改善斑马鱼的抑郁样行为；中剂量组对斑马鱼抑郁样行为改善效果较好，可以显著改善斑马鱼抑郁样行为，降低斑马鱼外周皮质醇含量，降低脑部促炎细胞因子TNF-α的表达。