灵芝乙醇提取物上调Syk抑制胰腺癌细胞SW1990增殖、迁移和侵袭的研究

王海 徐幸幸 马海 彭勇

胰腺癌是人类最恶性的实体瘤之一，其特征在于诊断晚，进展快，早期转移和化学耐药性。尽管近年来使用了越来越多的疗法，包括手术切除，化学疗法和放射疗法，但患者总体5年生存率仍<5%[1,2]。因此，迫切需要开发新的诊断和治疗策略，并阐明相关的分子机制，以提高胰腺癌的诊断准确性和临床治疗。灵芝系多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，具有补气安神，止咳平喘的功效，用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食[3]。研究发现，灵芝乙醇提取物具有抑制胰腺癌、肺癌、宫颈癌等肝癌、胃癌、乳腺癌细胞增殖的作用，表现出一定的抗肿瘤效果[4]。临床资料表明，灵芝提取物对胰腺癌[5]的治疗效果满意，可以延长生存期，提高患者生活质量。但是，灵芝乙醇提取物对胰腺癌细胞迁移和侵袭的功能与分子机制仍不清楚，生物标志物在肿瘤治疗中的应用尚需进一步验证。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)此前被证明在胰腺癌中低表达，能够抑制胰腺癌的生长和转移[6,7]。但是Syk是否参与灵芝乙醇提取物影响胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭过程尚未可知。基于此，本研究考察不同浓度的灵芝乙醇提取物对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并通过Syk基因探索其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 灵芝乙醇提取物(黄色粉末，含量为63.77 g/g生药，成都荣保生物科技开发有限公司)，胰腺癌细胞SW1990(美国典藏培养物保存中心)，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)，Lipofectamine 2000试剂(美国Invitrogen公司)，Syk过表达质粒pcDNA3.1-Syk、过表达空载质粒pcDNA3.1(上海GenePharma公司)，细胞核相关抗原Ki67(Nuclear associated antigen Ki67，Ki67)小鼠单克隆抗体、上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)小鼠单克隆抗体、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin)小鼠单克隆抗体及Syk小鼠单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗(英国Abcam公司)。

1.2 细胞培养 细胞SW1990在RPMI 1640培养基中(10%胎牛血清、100 mg/ml链霉素和100 U/ml青霉素)培养，并在37℃、5% CO2的培养箱内生长。

1.3 细胞分组与处理 将对数生长期的细胞SW1990分为以下几组：对照组(未给予药物)，低剂量药物组(给予25 μg/ml灵芝乙醇提取物)，中剂量药物组(给予50 μg/ml灵芝乙醇提取物)，高剂量药物组(给予100 μg/ml灵芝乙醇提取物)，pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)，pcDNA3.1-Syk组(转染pcDNA3.1-Syk)，高剂量药物组+pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1并给予100 μg/ml灵芝乙醇提取物)，高剂量药物组+pcDNA3.1-Syk组(转染pcDNA3.1-Syk并给予100 μg/ml灵芝乙醇提取物)。其中，灵芝乙醇提取物作用时间为48 h。在进行细胞转染时，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂将pcDNA3.1-Syk、pcDNA3.1质粒转染到40%～50%汇合状态的SW1990细胞。转染24 h后，使用不同浓度的灵芝乙醇提取物处理。

1.4 MTT比色法检测细胞存活 收集不同处理的细胞SW1990，按1×105个/ml的密度接种于96孔板。培养48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液，每孔20 μl，37℃孵育4 h，加入二甲基亚砜150 μl，剧烈振荡10 min以溶解结晶。之后于酶标仪检测490 nm波长处的细胞吸光度(OD)值，按照公式计算细胞存活率(%)，细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.5 平板克隆测定细胞克隆形成 将不同处理的细胞SW1990接种到6孔板中，每孔5×102个细胞。将细胞培养2～3周。当肉眼可见细胞集落时，终止细胞培养，将SW1990细胞用4%多聚甲醛固定，Giemsa染色10～30 min，并在显微镜下统计细胞克隆形成数。

1.6 Transwell小室法评估细胞迁移和侵袭 侵袭测定：用无血清RPMI 1640培养基将SW1990细胞调整至1×106个细胞/ml，取200 μl细胞置于Matrigel 预涂的Transwell上室中，并在下室添加600 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基。培养48 h后，将Transwell膜用4%多聚甲醛固定，用结晶紫染色10 min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。在显微镜下观察侵袭膜的细胞数目。迁移测定：Transwell上室不涂Matrigel，其余步骤相同。

1.7 免疫印迹实验(western blot)分析Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表达 将SW1990细胞在冷RIPA缓冲液中裂解，然后用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将其转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。之后，将PVDF膜在5%脱脂奶粉中一起于4℃孵育3 h。然后，将膜与一抗在4℃孵育过夜，然后与二抗在37℃孵育1 h。使用ECL检测免疫复合物。通过Image-Pro软件分析相对蛋白表达，并将GAPDH用作内参。

2 结果

2.1 灵芝乙醇提取物对SW1990细胞增殖的影响 与对照组相比，低、中、高剂量药物组的细胞存活率明显减少，克隆形成数显著降低，二者均呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 灵芝乙醇提取物对SW1990细胞增殖的影响

2.2 灵芝乙醇提取物对SW1990细胞迁移侵袭的影响 与对照组相比，低、中、高剂量药物组细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数均明显减少，并呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2。

表2 灵芝乙醇提取物对SW1990细胞迁移侵袭的影响 个,

2.3 灵芝乙醇提取物对SW1990细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表达的影响 与对照组相比，低、中、高剂量药物组SW1990细胞中Ki67蛋白表达水平明显降低，E-cadherin蛋白表达水平显著升高，N-cadherin蛋白表达水平明显减弱，Syk蛋白表达水平显著增强，且均呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1，表3。

图1 灵芝乙醇提取物对SW1990细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk蛋白表达的影响

表3 灵芝乙醇提取物对SW1990细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表达的影响

2.4 Syk对灵芝乙醇提取物作用的SW1990细胞增殖迁移侵袭的影响 与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-Syk组、高剂量药物+pcDNA3.1组、高剂量药物+pcDNA3.1-Syk组的细胞存活率明显减少，克隆形成率显著降低，迁移细胞数明显减少，侵袭细胞数显著降低(P<0.05)。高剂量药物+pcDNA3.1-Syk组SW1990细胞的细胞存活率、克隆形成数、迁移细胞数和侵袭细胞数均显著低于pcDNA3.1-Syk组或高剂量药物+pcDNA3.1组(P<0.05)。见表4。

表4 Syk对灵芝乙醇提取物作用的SW1990细胞增殖迁移侵袭的影响

2.5 Syk对灵芝乙醇提取物作用的SW1990细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表达的影响 与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-Syk组、高剂量药物组+pcDNA3.1组、高剂量药物+pcDNA3.1-Syk组细胞中Ki67蛋白表达水平明显降低，E-cadherin蛋白表达水平显著升高，N-cadherin蛋白表达水平明显减弱，Syk蛋白表达水平显著增强(P<0.05)。与pcDNA3.1-Syk组或高剂量药物+pcDNA3.1组相比，高剂量药物+pcDNA3.1-Syk组SW1990细胞的Ki67蛋白表达水平明显降低，E-cadherin蛋白表达水平显著升高，N-cadherin蛋白表达水平明显减弱，Syk蛋白表达水平显著增强(P<0.05)。见表5，图2。

图2 Syk对灵芝乙醇提取物作用的SW1990细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的影响

表5 Syk对灵芝乙醇提取物作用的SW1990细胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin及Syk表达的影响

3 讨论

癌症转移是恶性肿瘤的特征之一，是大多数癌症患者死亡的主要原因。癌症转移包括许多相互依存的过程，如癌细胞不受控制的生长，向周围组织的侵袭，向身体远处的迁移以及其他器官的定植[8]。其中，肿瘤细胞迁移是转移的先决条件，肿瘤细胞参与迁移和侵袭过程以促进肿瘤进展和转移。因此，靶向肿瘤细胞运动性已在癌症治疗中引起了极大的关注[9]。灵芝是一种具有显著[10]的抗肿瘤作用的中草药，可以改善胰腺癌[5]和肝癌患者的生活质量。在本项研究中，以胰腺癌细胞SW1990为研究对象，以评估灵芝乙醇提取物对胰腺癌的治疗效果。结果表明，灵芝乙醇提取物可以有效抑制SW1990细胞的生长和转移。值得注意的是，本研究揭示了Syk基因介导灵芝乙醇提取物抗胰腺癌细胞增殖和转移的过程，本研究提供了有关了解灵芝乙醇提取物治疗肿瘤进展效果的有用信息。

灵芝是一种药用真菌，自古以来，它已被用于预防和治疗各种疾病，例如慢性肝炎，肾炎，高血压，支气管炎和致瘤性疾病[11]。越来越多的研究报告称，灵芝可以显著抑制多种癌症的发生，侵袭和转移，包括结肠癌[12]，肺癌[13]和白血病[14]，此外，灵芝可以保护肝脏，几乎没有毒性，并且可以减少化学疗法对正常细胞的毒性[15]，这些使得灵芝成为抗癌的有希望的潜在治疗和化学预防候选药物。研究表明，灵芝提取物可以抑制乳腺癌细胞的活力、迁移和侵袭能力[8]，灵芝多糖可以减弱宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力，促进宫颈癌细胞的凋亡并限制细胞周期，并且伴随着E-cadherin表达的增加和N-cadherin表达的减少[16]。在本项研究中，结果显示，25、50、100 μg/ml剂量的灵芝乙醇提取物可以抑制胰腺癌细胞SW1990的存活、克隆形成、迁移和侵袭能力，并降低Ki67和N-cadherin蛋白表达，提高E-cadherin蛋白表达，均呈现一定的剂量依赖性，这表明灵芝乙醇提取物在胰腺癌中具有抗肿瘤活性，与前人报道[4,8,13]一致。

Syk是一种细胞质非受体酪氨酸激酶，在多种造血细胞中广泛表达。在癌症中，Syk与细胞迁移，淋巴血管浸润，微血管密度和/或转移形成之间也存在相关性[17]。一些研究表明，Syk在癌症中具有双重作用，在白血病中，Syk是众所周知的癌基因和肿瘤启动子[18]。相反，在乳腺癌中，它被认为是肿瘤抑制因子[19]。SyK的抑制可显著降低卵巢肿瘤细胞的侵袭性[20]和阻止神经胶质瘤细胞的增殖，迁移和菌落形成[21]。另一些资料显示，Syk在乳腺癌和其他癌中的表达降低与存活率降低和转移风险增加相关，Syk表达的增加增强了E-cadherin/catenin的磷酸化和稳定化，从而抑制细胞迁移和侵袭[22]。在胰腺导管腺癌中，syk被确定为肿瘤分化/抑制因子的标志，通过调节胰腺导管腺癌细胞生长和侵袭作为肿瘤抑制剂[23]。本实验检测到了与乳腺癌[22]、胰腺导管腺癌[23]相同的结果，Syk过表达明显减少胰腺癌细胞的细胞存活率、克隆形成率、迁移细胞数、侵袭细胞数、Ki67、N-cadherin蛋白表达水平，显著增加E-cadherin蛋白表达水平，为Syk作为胰腺癌肿瘤抑制因子提供了新的证据。

尽管灵芝及其提取物在肿瘤治疗方面的益处已被广泛报道，但其抗肿瘤的机制仍有待于阐明。Wang等[24]学者揭示了，程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)是灵芝介导的免疫调节的重要靶标，灵芝可能通过减少PD-1蛋白和增强免疫反应(例如T细胞浸润)来调节免疫反应，以抵抗疾病的发展，例如肿瘤的生长。Wu等[25]首次报道了灵芝多糖可能促进人前列腺癌细胞凋亡的过程，该过程部分是通过非甾体类抗炎药激活基因-1(Non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1，NAG-1)诱导介导的。本研究进一步评估灵芝乙醇提取物抗胰腺癌的分子机制，发现低、中、高剂量的灵芝乙醇提取物以剂量依赖方式促进Syk的蛋白表达，提示Syk基因可能与灵芝乙醇提取物治疗癌症有关。另外，本研究还观察到，Syk过表达后，灵芝乙醇提取物对SW1990细胞存活、克隆形成、迁移、侵袭、Ki67、N-cadherin蛋白表达的抑制作用被增强，且灵芝乙醇提取物对细胞E-cadherin蛋白表达的促进作用也被增强。这些结果证实，上调Syk基因是灵芝乙醇提取物发挥胰腺癌抑制作用的重要途径之一。

总之，本研究表明，灵芝乙醇提取物能够以剂量依赖方式抑制胰腺癌细胞SW1990的增殖、迁移和侵袭，并且，Syk基因的上调可以增强灵芝乙醇提取物的这些功能。本研究确定了Syk为灵芝乙醇提取物抗胰腺癌增殖和转移的分子靶标，这可能为灵芝作为胰腺癌和其他癌症类型的抗癌药提供一种新思路。