苓甘五味姜辛汤治疗慢性支气管炎网络药理学研究

蒋先伟，马战平

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中医医院，陕西 西安 710003)

慢性支气管炎(Chronic bronchitis)为临床常见的慢性呼吸道疾病，是累及气管、支气管黏膜及周围组织的慢性非特异性炎症。临床中以反复发作的咳嗽、咯痰为主要症状，可伴或不伴喘息，且具有病程长、起病缓慢、反复发作的特点，该病影响患者生活质量，严重威胁患者健康[1]。近年来，随着中国老龄化社会加剧、环境污染及不健康生活方式等因素的影响，该病发病率逐年递增，且发病人群出现年轻化趋势[2]。目前，西药治疗在临床中应用较为广泛，但其长期疗效不佳，因此，慢性支气管炎的临床治疗方案应进一步优化。

根据慢性支气管炎临床咳、痰等症状，可将其归于中医“咳嗽”“痰饮”范畴，其根本病机多与肺、脾、肾三脏虚损，痰饮留停肺内有关。痰饮内伏，每逢邪气外袭则勾动内邪，促使疾病加重。《灵枢·邪气脏腑病形》云：“形寒寒饮则伤肺。”而苓甘五味姜辛汤为张仲景所创，首载于《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治第十二》，功擅温肺化饮，在临床中疗效显著。匡奕亮等[3]研究显示，苓甘五味姜辛汤组对比常规西药治疗组，可有效提高治疗效果，且治疗安全性更高。研究[4]发现，苓甘五味姜辛汤可降低IL-2、IL-4，调节气道炎症因子表达，起到治疗慢性支气管炎的作用。

网络药理学是将系统生物学及药理学整合后，经网络数据库检索及计算机虚拟计算后，构建出“药物-成分-靶点-通路-疾病”间可视化网络模型，进而通过分析，得出药物与疾病相关联的关键靶点，从而预测药物治疗疾病的机制[5]。该方法贴合中药复方多靶点、多通路的治疗特点，以及中医药对疾病的认知。故本研究采用网络药理学方法探究苓甘五味姜辛汤治疗慢性支气管炎可能关联的靶点及通路，为挖掘苓甘五味姜辛汤的潜在价值提供思路及依据。

1 材料与方法

1.1 苓甘五味姜辛汤有效成分的筛选及获取

利用中药药理学数据库及分析系统平台(TCMSP)搜索苓甘五味姜辛汤中茯苓、甘草、南五味子、干姜、细辛的全部化学成分。依据药物ADME(Absorption，distribution，metabolism，excretion)特性，将口服生物利用度(Oralbioavailability，OB)≥30%，以及类药性(Drug-likeness，DL)≥0.18作为筛选指标，获取符合条件的活性成分。

1.2 苓甘五味姜辛汤潜在靶点和相关疾病靶点的获取

基于TCMSP数据库，收集茯苓、甘草、五味子、干姜、细辛所有有效成分靶点，并通过Uniprot数据库将靶点蛋白名更换为官方名称。利用DrugBank、GeneCards及OMIM数据库，将“chronic bronchitis”作为搜素关键词进行搜索，将所获取的疾病靶点进行整合、去重后即得慢性支气管炎的疾病靶点。

1.3 中药复方调控网络构建

首先利用PERL软件将获取到的药物活性成分及潜在靶点与疾病靶点进行比对筛选，得出药物活性成分可作用于疾病靶点的相关成分与靶点，然后将网络数据导入Cytoscape 3.8.0 软件构建中药复方调控网络，网络图中node1代表药物，node2代表靶点，edge代表不同节点间的相互关系。

1.4 苓甘五味姜辛汤与疾病交互靶点筛选及PPI网络构建

应用R软件进行药物与疾病交互靶点的并集获取，并绘制出Venn图。利用STRING网络平台构建网络互作模型，最低相互作用阈值设为(>0.9)，并去除游离在外的靶点，获得PPI网络互作模型图。将获得的网络用Cytoscape 3.8.0 软件中CytoNCA插件进行核心靶点筛选，获得相关核心基因。

1.5 GO生物学过程与KEGG信号通路富集分析

采用 R 4.0.2 的 Bioconductor 数据包进行靶点GO生物学功能及KEGG通路富集分析，设置P值为 0.05，q值为0.05进行分析，输出结果并绘制相应 barplot柱状图及气泡图，根据最后结果，得出关键的生物学过程及相关通路，从而探讨苓甘五味姜辛汤治疗慢性支气管炎的相关机制。

2 结果

2.1 苓甘五味姜辛汤活性成分筛选

通过TCMSP平台检索，苓甘五味姜辛汤中茯苓得到化学成分34种，甘草280种，南五味子39种，干姜148种，细辛192种。根据口服利用度(OB)及类药性(DL)筛选得出苓甘五味姜辛汤共有133种主要活性成分，其中茯苓15种，甘草92种，南五味子13种，干姜5种，细辛8种。

2.2 苓甘五味姜辛汤潜在靶点获取

将获取到的主要活性成分在TCMSP平台中再次搜索，并与潜在靶点逐一匹配，去除无靶点活性成分，得到苓甘五味姜辛汤潜在靶点。其中，茯苓31个靶点，甘草1 769个，南五味子7个，干姜54个，细辛164个，共获得潜在靶点2 026个。然后将获得的靶点利用Uniprot数据库平台将靶点名更正为官方基因名，并剔除重复，最终共获得1 708个潜在靶点。

2.3 慢性支气管炎已知靶点获取

以“chronic bronchitis”作为搜索关键词，在DrugBank、GeneCards、OMIM数据库进行搜索，获得已知与疾病相关的靶点，其中，DrugBank获取到58个，GeneCards获取到1 853个，OMIM获取到43个，整合3个数据库获得的靶点信息并剔除重复后，最终获得疾病相关基因1 893个。

2.4 疾病-药物靶点整合与获取共同靶点

应用R语言软件，将获得的药物潜在靶点及疾病相关靶点进行整合，获取到交集基因，然后通过R软件绘制韦恩图(venn)，并记录苓甘五味姜辛汤治疗慢性支气管炎的交集基因，最终获得共同靶点125个。见图1。

图1 药物-疾病交集基因韦恩图

2.5 中药复方调控网络的构建

将“2.4”中获得的交集基因导入Cytoscape 3.8.0软件，构建药物-成分-疾病-靶点的中药复方调控网络图(见图2)，其中，外周节点代表药物成分(三角形代表茯苓，倒三角代表甘草，菱形代表南五味子，八边形代表干姜，椭圆形代表细辛，平行四边形代表药物共有成分)，矩形方阵代表作用靶点。按照Degree进行排序，其节点越大，代表其在网络中越重要。其中，节点度值居前10位的靶点为PTGS2、ESR1、AR、HSP90AB1、NOS2、PPARG、CDK2、ESR2、CCNA2、SCN5A。节点度值较高的化学成分为槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A等。

图2 中药复方调控网络

2.6 PPI网络构建及核心靶点筛选

将获得的125个交集基因上传至STRING网络平台，进行搜索，更改最低相互作用阈值为>0.9，并除去游离节点，得到图3，其中每个节点代表每种蛋白，每条边代表蛋白之间的相互作用，共有125个节点，522条边。将所获得的网络导入Cytoscape 3.8.0软件，利用CytoNCA插件进一步计算网络节点的DC、BC、CC、EC、LAC及NC值，得到网络中DC中位数为6.5，BC中位数为42.64，CC中位数为0.150 9，EC中位数为0.046，LAC中位数为2.944，NC中位数为3.675。根据网络药理学筛选方法，得到关键基因39个，再次进行分析后获得核心基因15个，分别是ESR1、AKT1、CCND1、MAPK14、JUN、STAT3、MAPK1、NR3C1、TP53、CDKN1A、MAPK8、RELA、MAPK3、MYC、RB1。这些靶点在网络中作为核心靶点，在苓甘五味姜辛汤治疗慢性支气管炎中起重要作用。见图4。

图3 交集基因互作网络

图4 PPI核心网络筛选

2.7 GO富集分析与KEGG分析

应用R语言将交集基因进行GO富集分析与KEGG通路富集分析，并绘制相应气泡图。GO分析共获得GO条目2 441条，其中生物过程(BP)主要条目为活性氧代谢过程(Reactive oxygen species metabolic process)、抗生素反应(Response to antibiotic)、细胞对氧化应激的反应(Cellular response to oxidative stress)、对细菌源分子的反应(Response to molecule of bacterial origin)、对脂多糖的反应(Response to lipopolysaccharide)、细胞对化学应激的反应(Cellular response to chemical stress)等。细胞组分(CC)主要条目为细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物(Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex)、蛋白激酶复合物(Protein kinase complex)、转录调节复合物(Transcription regulator complex)等。分子功能(MF)主要条目为组蛋白激酶活性(Histone kinase activity)、核受体活性(Nuclear receptor activity)、蛋白磷酸酶结合(Protein phosphatase binding)等(见图5)。KEGG信号通路富集分析共获得165条，选取其中富集程度最高的30条通路，形成气泡图，其中，气泡越大代表富集条目越多(见图6)。主要信号通路为PI3K-Akt 信号通路、IL-17 信号通路、TNF信号通路等。

图5 GO分析气泡图

图6 KEGG通路富集分析气泡图

3 讨论

慢性支气管炎作为临床常见病、多发病，其反复发作及迁延难愈的特点长期困扰医患。而中医药治疗慢性支气管炎效果良好，在缓解临床症状及疾病长期管理上优势独到。苓甘五味姜辛汤作为治疗“咳嗽”“痰饮”的经典名方，应用广泛，临床疗效较好。因此，采用网络药理学分析方法，挖掘苓甘五味姜辛汤治疗机制，为临床提供科学依据，具有重要意义。

3.1 中药复方调控网络

通过对中药复方调控网络的分析发现，其中主要化学成分为槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A等。主要作用靶点为PTGS2、ESR1、AR、HSP90AB1、NOS2、PPARG、CDK2、ESR2、CCNA2、SCN5A等。槲皮素及山奈酚是甘草的活性成分，具有良好的抗炎作用，如李林蔓等[6]发现，槲皮素可通过调节Th17/Treg细胞平衡、HO-1表达而起到较好的抗炎作用，亦有报道[7]称槲皮素可降低肺泡灌洗液及肺组织中IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子水平，从而抑制香烟烟雾引起的气道重塑。研究[8]表明，山柰酚具有明显的抗炎作用，其作用机制主要包括调节促炎酶的活性及炎症相关基因表达等。赵妍等[9]证实，山柰酚可减轻脂多糖导致的小鼠急性肺损伤，其机制可能是通过抑制多种促炎因子，如NF-κB、IL-1β、HO-1、PTGEs等 mRNA的表达，以及促进抗炎因子HO-1 mRNA的表达而发挥保护作用。β谷甾醇是一种植物甾醇，现代研究较少，但也有报道其具有抗菌、抗炎、抗真菌的作用[10]。严宁等[11]证实，β谷甾醇可通过调节IL-1β、IL-6及TNF-α水平，改善大鼠心肌缺血再灌注损伤的炎症反应。茯苓酸A是茯苓的主要有效成分，具有抗氧化、抗炎的功效，秦劭晨等[12]研究发现，茯苓酸具有抑制TNF-α诱导SH-SY5Y的炎症及氧化应激损伤作用。而在主要作用靶点中，PTGS2与慢性炎症的发生、发展密切相关，前列腺素-内过氧化物合酶2(PTGS2)是通过产生炎症介质前列腺素E2(PGE-2)从而起到调节炎症的作用[13]。因此，可以推测苓甘五味姜辛汤治疗慢性支气管炎主要是发挥其抗炎、抗氧化及减轻损伤等方面作用。

3.2 PPI网络及核心靶点

PPI核心网络筛选主要结果为雌激素受体1(ESR1)、丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK14、MAPK1、MAPK8、MAPK3)、信号传导和转录激活因子3(STAT3)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、转录因子(JUN)等。STAT是一种转录调节因子，该信号参与了先天免疫、适应性免疫，急、慢性炎症反应及肿瘤等疾病的发生[14]。STAT3作为传导因子，可被各种刺激激活，从而在各种炎症反应中起到信号转导作用，研究[15]表明，IL-6结合受体后可活化JAK1，并促使STAT3的磷酸化和转录激活，最终调控T细胞的分化及炎症反应。王月月等[16]证实，哮喘患者体内巨噬细胞向M2极化，协同共刺激分子B7-H3促进CD4+T细胞向Th2方向极化与巨噬细胞中STAT3表达增加相关。MAPK信号通路作为已知炎症相关性信号通路，其由p38、ERK及JNK信号通路组成，是参与炎症反应的主要组成部分[17]。刘茈蕊等[18]发现，大承气汤可能通过调节p38 MAPK与ERK1/2这2条MAPK途径磷酸化进程来抑制哮喘小鼠炎症表达。周吉等[19]研究表明，使用P38 MAPK抑制剂可显著减轻大鼠机械通气相关肺损伤中炎症因子、炎症细胞的趋化。因此，STAT3及MAPK信号通路在慢性支气管炎的发病过程中起着举足轻重的作用。

3.3 苓甘五味姜辛汤治疗慢性支气管炎主要涉及的生物通路

通过KEGG通路富集分析后，得到的主要通路有PI3K-Akt 信号通路、IL-17 信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路、人巨细胞病毒感染、小细胞肺癌等。在慢性支气管炎现代机制研究中，炎症反应成为其核心机制，且存在黏液高分泌、氧化应激、气道重塑等多种方式。结合慢性支气管炎发病机制及富集通路，笔者推测苓甘五味姜辛汤主要通过缓解炎症反应发挥其治疗作用。在慢性支气管的炎症反应中，由多种炎症因子广泛参与，除较为常见的白介素-6、肿瘤坏死因子(TNF)外，由Th17细胞特异性分泌的白介素-17，可刺激支气管上皮细胞释放 IL-8 募集中性粒细胞，参与炎症反应[20]。TNF可诱导细胞内多种信号通路，包括细胞凋亡、炎症、免疫等，其激活后结合的受体TNFR2可激活NF-κB通路，包括PI3K依赖性NF-κB通路及JNK通路，与炎症的发生、发展密切相关[21]。研究表明，PI3K/AKT/m TOR通路对Th17细胞具有积极的调控作用，KUREBAYASHI等[22]研究发现，通过PI3K/m TORC1抑制剂及敲除raptor，抑制AKT活性，进而影响了体外及体内Th17细胞分化，使IL-17A、IL-17F产生减少。而有研究[23]亦证实了PI3K信号通路与肺组织中嗜酸粒细胞増多、气道黏液分泌增多、气道高反应性的相关性。以上均提示，苓甘五味姜辛汤可能通过调节PI3K-Akt 信号通路(见图7)、IL-17 信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路发挥抗炎、抗氧化、影响黏液分泌等作用，从而达到治疗慢性支气管炎的效果。此外，GO富集分析得出苓甘五味姜辛汤主要通过活性氧代谢过程、抗生素反应、细胞对氧化应激的反应、对脂多糖的反应等生物过程发挥治疗作用。

图7 PI3K-Akt 信号通路

综上，本研究利用网络药理学方法，探讨了苓甘五味姜辛汤治疗慢性支气管炎的作用机制，发现具有治疗效果的主要成分为槲皮素、山奈酚、氨酚酸、β谷甾醇、茯苓酸A；主要作用靶点为ESR1、AKT1、CCND1、MAPK14、JUN、STAT3、MAPK1、NR3C1、MAPK3等。而根据GO富集分析及KEGG通路富集分析得出其主要通过活性氧代谢过程、抗生素反应、细胞对氧化应激的反应、对脂多糖的反应，以及通过PI3K-Akt 信号通路、IL-17 信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路等治疗慢性支气管炎。这些数据为临床应用及相关研究提供了一定依据，但本研究仍存在不足，还需动物实验加以验证。