三颗针炮制前后肝损伤保护及体外抗氧化作用比较研究

李 香，李雪营，邓先扩，许义红，唐方方，刘 杰

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000)

三颗针Berberidis Radix为小檗科植物小黄连刺BerberiswihonaeHemsl.、匙叶小檗BerberisvernaeSchneid.、细叶小檗BerberispoiretiiSchneid.、拟豪猪刺BarberissoulieanaSchneid.等同属植物干燥根，含小檗碱、药根碱、巴马汀等多种生物碱，具有泻火解毒、清热燥湿的功效。在贵州苗族聚集区，其被用于降血糖、抗菌、镇痛、保肝、抗氧化等[1-2]。由于三颗针资源丰富，采集方便，常代替黄连、黄柏药用。民间常将三颗针经酒制、醋制等炮制后使用[3]。研究发现，三颗针不同炮制方法对生物碱含量有一定影响，但炮制对其保肝、抗氧化作用的影响如何，尚未见相关报道。因此，本实验通过比较三颗针炮制前后在保肝、抗氧化上的作用，为三颗针开发应用提供参考依据，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级KM小鼠，雄性，体质量18～22 g，由中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供，实验动物许可证号SCKK(军)2012-2011。适应期喂养3 d，自由摄食与饮水。

1.2 药材与试药

三颗针采于贵州省福泉，经黔南民族医学高等专科学校魏学军教授鉴定为拟豪猪刺BarberissoulieanaSchneid.干燥根。经测定符合2015版《中华人民共和国药典：一部》要求。丙二醛(MDA)试剂盒(批号：20191016)、超氧化歧化酶(SOD)试剂盒(批号：20191015)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号：20191015)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(批号：20191017)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(批号：20191017)，所有试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；联苯双酯滴丸(北京协和药厂，批号：H11020980)；硫酸亚铁(无锡市亚泰联合化工有限公司，批号：GB/T664-1998)；水杨酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：Q/12HB3705-2018)；抗坏血酸(上海辰云化工有限公司，批号：190310)；H2O2(江西草珊瑚消毒用品有限公司，批号：20190403)；1，1-二苯基-2-三硝基肼自由基(合肥巴斯夫生物科技有限公司，批号：Y0303-100MG)；红星二锅头56°(北京红星股份有限公司，批号：GB/710781.2C级)；橄榄油(福建省嘉成生物科技有限公司，批号：SC10235012101843)。其余试剂均为分析纯。

1.3 仪器

KQ3200DV超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；RE52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DHG-9240A真空干燥箱(上海金山公司)；DRHH-S4(上海双捷实验设备有限公司)；DRHH-S4数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)；MR-96A酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；01040080型紫外分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；AF240型电子天平(瑞士METTLER)；0412-1型离心机(上海手术器械厂)。

2 方法

2.1 饮片炮制[4-5]

2.1.1 生品 取三颗针净制药材，切片，干燥备用。

2.1.2 醋制品 取净制三颗针药材180 g，分成3份，每份约60 g，加入30%米醋(18 mL)，闷润1.5 h，放入真空干燥箱，于160 ℃烘制20 min，取出备用。

2.1.3 酒制品 取净制三颗针药材180 g，分成3份，每份约60 g，加入30%黄酒(18 mL)，闷润1 h，放入真空干燥箱，于160 ℃烘制20 min，取出备用。

2.2 保肝作用

2.2.1 各制品溶液制备 称取生品、醋制品、酒制品各40 g，每种制品各3份。分别加入10倍量甲醇，超声提取(功率250 W，频率20 kHz)2次，每次1 h，抽滤，合并滤液，减压回收甲醇，浓缩液80 ℃水浴蒸干，浸膏真空干燥。根据预实验与生药用量，用0.5%CMC-Na溶解各制品浸膏，分别制得浓度为2.4 g·kg-1、0.6 g·kg-1高低剂量组药液，即得各制品溶液。

2.2.2 各对照组药液制备 用0.5%CMC-Na溶解联苯双酯滴丸内容物，配制成浓度为150 mg·mL-1阳性对照组溶液。0.5%CMC-Na溶液为正常对照组溶液。

2.2.3 对CCI4致小鼠肝损伤的保护作用[6-7]取90只雄性小鼠，随机分成9组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，三颗针各制品高、低剂量组(2.4 g·kg-1、0.6 g·kg-1)，联苯双酯组。按照20 mL·kg-1体积灌胃给药，正常对照组与模型组均给予等量0.5%CMC-Na溶液，每天灌胃1次，连续灌胃7 d。末次给药2 h后，除正常对照组外，其余各组小鼠均腹腔注射0.2%CCI4的橄榄油溶液20 mL·kg-1。禁食不禁水16 h后，称重，眼眶取血，小鼠脱臼处死，解剖取肝脏。

2.2.4 对白酒致小鼠肝损伤的保护作用[8]取90只雄性小鼠，随机分成9组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，三颗针各制品高、低剂量组(2.4 g·kg-1、0.6 g·kg-1)，联苯双酯组。正常对照组每天灌胃0.5%CMC-Na溶液，其余各组每天灌胃56°红星二锅头6 mL·kg-1，0.5 h后，按照20 mL·kg-1体积灌胃给药，正常对照组与模型组均给予等量0.5%CMC-Na溶液，其余各给药组灌胃给药，连续10 d。末次给药后禁食不禁水12 h，称重，小鼠脱臼处死，解剖取肝脏。

2.2.5 生化指标检测 肝脏指数计算：将“2.2.3”与“2.2.4”项下解剖的肝脏，用冰生理盐水洗去残留血迹，除去结蹄组织，滤纸吸干水分，称重，计算肝脏指数。

肝脏指数(%)=肝质量(g)/小鼠体质量(g)×100%

血清及肝组织活力测定：将“2.2.3”项小鼠眼眶取血后，放置2 h，以3 000 r·min-1速度离心15 min，分离出血清，按照试剂盒要求测定AST、ALT的活性。将“2.2.4”项小鼠解剖肝脏，取肝脏组织约0.2 g，加1.8 mL冰生理盐水，制成10%肝组织匀浆，以3 000 r·min-1速度离心15 min后取上清液，按照试剂盒要求测定MDA水平与SOD、GSH-Px活性。

2.3 体外抗氧化活性

2.3.1 清除羟自由基能力测定[9]取10 mL具塞试管，分别加入3 mmoL/L硫酸亚铁溶液2 mL、6 mmoL/L水杨酸-乙醇溶液2 mL，加入不同体积三颗针生品、酒制品、醋制品供试品溶液并定容到6 mL，加入1 mmoL/L过氧化氢溶液2 mL，摇匀于37 ℃水浴中反应30 min。于510 nm波长处测定吸光度AX，同法测定不加样液、过氧化氢的吸光度A0与AX0。均用蒸馏水作参比溶液。平行操作3次，按照：羟自由基清除率(%)=[A0-(AX-AX0)]/A0×100，计算羟自由基清除率。

2.3.2 清除DPPH测定[10]精密称定DPPH 10.03 mg于25 mL棕色瓶，用70%乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀备用。取10 mL具塞试管，加入不同体积的三颗针生品、酒制品、醋制品供试品溶液，加入DPPH溶液0.5 mL。用70%乙醇定容至5 mL，摇匀，室温暗处反应1 h，以乙醇作空白对照，于522 nm处测定吸光度值A1，DPPH溶液0.5 mL70%乙醇定容至5 mL及各不同体积供试品溶液吸光度A0及A2，平行操作3次，按照：DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100，计算DPPH自由基清除率。

2.4 数据分析

3 结果与分析

3.1 对CCI4致小鼠肝损伤血清生化指标及肝脏指数的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清的AST与ALT活性及肝脏指数有显著性升高(P<0.01)，说明实验造模成功。与模型组比较，三颗针各制品各剂量均可显著性降低小鼠肝损伤血清中的ALT活性(P<0.01)。除生品低剂量组外，其余各组均可显著性降低AST活性(P<0.01)。除生品与酒制品低剂量组外，其余各组可显著性降低小鼠肝脏指数，说明三颗针各制品对小鼠肝损伤肝肿胀具有一定缓解作用。见表1。

表1 三颗针各制品对小鼠肝损伤血清ALT、AST及肝脏指数的影响

3.2 对白酒致小鼠肝损伤肝组织中MDA水平及SOD、GSH-Px活性及肝脏指数的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠肝脏肝组织中MDA水平显著性升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性显著性降低(P<0.01)，说明实验造模成功。与模型组比较，三颗针各制品可显著性降低MDA水平(P<0.01)，除生品、酒制品、醋制品低剂量外，其余各组可升高SOD、GSH-Px活性。酒制品、醋制品高剂量组可显著性降低小鼠肝脏指数，说明对小鼠肝损伤肝肿胀具有一定缓解作用。见表2。

表2 三颗针各制品对小鼠肝组织中各活性水平及肝脏指数的影响

3.3 体外抗氧化作用、清除羟自由基与DPPH测定

按照“2.3.1”与“2.3.2”项下操作，测定Vc、生品、酒制品、醋制品对羟基自由基与DPPH的清除率，随着浓度增加，对羟基自由基与DPPH的清除率也随之升高，根据各浓度清除率，计算其IC50，结果见表3。

表3 三颗针各制品体外抗氧化性能力的测定

4 讨论

三颗针含小檗碱、药根碱、巴马汀等多种生物碱，具有泻火解毒、清热燥湿的功效。在贵州都匀主要用于降血糖、抗菌、镇痛、保肝、抗氧化等。三颗针有生品、酒制品、醋制品等加工炮制应用。前期研究已确定三颗针酒制、醋制加工炮制工艺，且研究表明含有小檗碱、药根碱等生物碱成分的中药具有保肝、抗氧化作用。而三颗针加工炮制对保肝与抗氧化作用的影响鲜见报道。

通过查阅文献，白酒与CCI4致小鼠急性肝损伤是比较经典的肝损伤模型，白酒与CCI4在体内酶作用下，生成一系列自由基，自由基通过与脂肪酸的过氧化反应，使肝细胞的AST与ALT等大量释放，导致血清中AST与ALT急剧上升，因此，临床上把AST与ALT水平作为判断肝损伤程度的诊断指标。生物机体内具有GSH-Px与SOD等重要抗氧化酶，具有一定的抗氧化能力，MDA水平高低可以反映体内脂质过氧化的高低。

维生素C是一种天然抗氧化剂，主要来源于食品与药品，是人体不可缺少的维生素之一。VC可以清除羟基自由基、DPPH自由基等。本实验选取VC作为阳性对照考察三颗针各制品的抗氧化活性。

结果表明，三颗针各制品对小鼠肝损伤肝肿胀具有一定缓解作用，各制品可显著性降低CCI4致小鼠肝损伤血清中的ALT与AST活性(P<0.01)，各制品可升高白酒致小鼠肝损伤肝组织SOD、GSH-Px活性，与剂量存在相关性。与生品比较，酒制品、醋制品显著性降低MDA水平(P<0.01)。三颗针抗氧化活性大小为：醋制品>酒制品>生品。

综上，三颗针各制品具备一定的保肝与抗氧化活性，并呈一定剂量相关性。炮制后的保肝与抗氧化活性明显增强，研究表明，三颗针酒制及醋制后，其盐酸小檗碱与盐酸药根碱含量明显增加。而小檗碱、药根碱等生物碱具有一定的保肝与抗氧化作用，这可能是三颗针炮制后的保肝与抗氧化作用优于生品的原因之一，今后将对其作用机制进行深入研究，为三颗针及炮制品的开发利用奠定坚实基础。