基于UPLC-LTQ-Qrbitrap代谢组学技术的不同产地黄芩组分比较研究

吴样明，邵 坚，孙函静，甘 侠，余明镜，季巧遇，2*

(1.江中药业股份有限公司，江西 南昌 330004；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004)

黄芩为唇形科植物ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，临床中常用于治疗湿温、暑湿、胸闷呕恶、湿热痞满等病症[1]。黄芩主要产于我国黑龙江、辽宁、内蒙古等地；其中热河黄芩以药效好、品质佳而被市场认可，是属于河北承德产的道地药材[2]。不同产地黄芩资源物质基础存在一定的差异，仅通过单个指标黄芩苷进行质量评价有一定局限性，不利于黄芩的临床应用和研究。不同产地的黄芩与传统道地产区热河黄芩内在的物质基础是否一致仍然不确定，故对道地黄芩与其他产区黄芩的物质内涵进行一致性评价非常重要。本研究基于LTQ-Orbitrap技术对道地药材热河黄芩与山西闻喜、陕西澄城黄芩进行代谢组学分析，旨在揭示不同产地黄芩与道地产区黄芩中化学组分的一致性和差异性，为黄芩道地药材化学表征及优势资源筛选提供一定的科学依据。

1 仪器与材料

1.1 材料

黄芩药材来自河北承德县、山西闻喜县、陕西澄城县，每个产地4个采集点，且每个采集点2批次，共24批次黄芩药材，样品信息详见表1。

表1 样品信息

1.2 仪器

DionexUitiMate 3000(Thermo Fisher 科技有限公司)，ORBITRAP ELITE 质谱仪(Thermo 公司)，MSA224S电子天平(德国Sartorius)，数控超声波清洗器(KQ1000KDE型，40 kHz，昆山市仪器超声有限公司)，碎机(A11BS025，IKA)。

1.3 试剂

甲醇、乙腈为色谱纯级(Merck KGaA公司)，甲酸为质谱级(Thermo Fisher 科技有限公司)，超纯水(Millipore 公司，美国)。

2 方法

2.1 样品制备

取本品中粉约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，称重，用甲醇补足，摇匀，用0.22 μm微孔膜滤过，取续滤液备用。质控样本(QC样)为各待测样品等量混合而成。QC样本每5针进样结束后进一次样，用于评估仪器的稳定性。

2.2 色谱条件与质谱条件

2.2.1 色谱条件 色谱条件：Waters XSelect HSS T3 色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；流动相为0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～18 min，8%B→35%B；18～21 min，35%B→60% B；流速0.3 mL·min-1；柱温40 ℃，进样量2 μL。

2.2.2 质谱条件 质谱条件：FT Orbitrap 质量检测器，电喷雾(ESI) 离子源，喷雾电压4.0 kV，管状透镜电压110 V，扫描范围m/z100～800；毛细管温度350 ℃；鞘气流量为30 Psi；辅助气流量为10 Psi；样品进行全扫描，分辨率R设为30 000；二级质谱采用数据依赖性扫描，从上一级峰度最高的3个峰选取进行CID 碎片扫描。

2.3 数据处理

将采集的质谱数据进行数据预处理，其中包括去卷积、校准、峰对齐、峰提取，获取数据矩阵。将处理的数据矩阵导入SIMCA-P 14.1(Umetrics，umeå，Sweden) 软件，对数据矩阵归一化、标准化处理，分别进行PCA无监督分析、正交偏最小二乘-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)等多元统计分析。OPLS-DA分析中根据变量VIP(对分组贡献值)的大小(VIP> 1，规格化方法为Par)和组间变化的显著性(P<0.05)进行黄芩产地间差异性代谢产物筛选。

3 结果

3.1 黄芩代谢物的鉴定

MassBank数据库结合文献报道[1]，根据化学成分的保留时间、质荷比及碎片离子信息对黄芩成分结构进行指认，共推断鉴定出25个化合物，详见表2。

表2 黄芩成分鉴定结果

3.2 主成分分析(PCA)

图1 不同产地黄芩样品PCA得分图

图2 不同产地黄芩样品PCA荷载图

3.3 河北承德与山西闻喜黄芩样品代谢差异物分析

图3 两产地黄芩OPLS-DA得分图

图4 Permutation Test

3.2.2 差异物分析 采用OPLS-DA模型VIP值(VIP>1)，并结合t检验(t-test)的P值(P<0.05)来寻找差异性表达代谢物。如表3所示，共筛选出4种差异代谢差异物，山西闻喜黄芩中Oroxylin A-7-O-glucuronopyranoside量高于河北承德，其余3个代谢产物均低于河北承德黄芩。

表3 两产地黄芩样品差异代谢物鉴定结果

3.4 河北承德与陕西澄城黄芩样品代谢差异物分析

图5 两产地黄芩OPLS-DA得分图

图6 Permutation Test

3.2.4 代谢差异物分析 采用OPLS-DA模型VIP值(VIP>1)，并结合t检验(t-test)的P值(P<0.05)来寻找差异性表达代谢物。如表4所示，共筛选出9种差异代谢差异物，陕西澄城黄芩中Trihydroxy-monomethoxyflavone、Tenaxin I倍性变化高于河北承德，其余7个代谢产物均低于热河黄芩。

表4 两产地黄芩样品差异代谢物

4 讨论

黄芩作为中医寒凉药的代表具有很高药用价值和经济价值。植物化学研究表明黄芩含有黄酮类、挥发性油、萜类、多糖等多种化学成分[2-4]，而黄酮类成分被认为是黄芩中特征性成分。现代药理研究黄芩广泛的药理活性，具有神经保护作用、抗炎、保肝作用、抗肿瘤、抗菌、抗氧化对免疫系统的作用、对肝脏的保护作用、抗肿瘤作用、抗菌抗病毒作用、抗氧化作用等药理作用[5-11]。不同产地来源药材化学组分存在差异性，对临床药效存在直接的影响。代谢组学是系统生物学的重要组成部分，其特点是以组群指标成分分析为基础，高通量检测方法和多元数据处理为手段。药用植物中活性成分本质上为植物代谢产物，运用代谢组学技术对道地产区黄芩和其他产地黄芩组分分析有利于黄芩资源评价。本研究以道地产区热河黄芩为控制组，与其他产地黄芩进行代谢组进行比较分析，通过主成分分析可以清晰判别不同产地黄芩，OPLS-DA分析筛选出热河黄芩与与其他产地黄芩差异代谢物，为不同产地黄芩物质表征及黄芩品质评价提供了科学依据。