γ干扰素释放试验在不同年龄肺结核患者中阳性程度比较

胡开明，王 席，陶 芳，朱 梅

安徽医科大学附属巢湖医院检验科，安徽合肥 238000

结核病是由结核分枝杆菌引起的致死性传染病。据WHO估计，每年新发结核病患者1 000万，约有150万结核病患者死亡，位居各种传染病致死原因之首[1]。早期、准确识别结核病对及时分诊、快速启动抗结核治疗，从而控制结核病传播有重要意义。目前结核病诊断试验中，γ干扰素释放分析因其较高的特异性和敏感性越来越受到重视，已被纳入各种诊疗指南或专家共识[2-3]，但各种分析报道有较大差异[4-7]。有研究分析发现，γ干扰素释放试验(TSPOT.TB)结果可能会受免疫状态、年龄、体质量指数(BMI)、淋巴细胞数等因素影响[8]。本研究在平衡性别、病程、BMI、免疫状态等因素后分析不同年龄肺结核患者TSPOT.TB阳性程度的变化，为该试验在临床的合理应用提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年6月至2018年6月入住本院的TSPOT.TB结果为阳性的245例初治肺结核患者作为研究对象，所有病例诊断均按照肺结核诊断标准：WS288-2017[9]执行，其中男198例，女47例；痰涂片和/或培养阳性85例，涂阴160例。TSPOT.TB在入院后1周内完成检测且采集外周血时未启动抗结核治疗。根据年龄分为3组，其中青年组(18～44岁)102例，中年组(>44～59岁)39例，老年组(>59岁)104例。分别回顾性分析各组患者性别、BMI、吸烟史、病程(从发病到检测间隔时间)等资料，其中BMI分为<18.5 kg/m2、18.5 kg/m2≤BMI<24 kg/m2及≥24 kg/m23个等级。所有病例均排除乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人类免疫缺陷病毒感染、恶性肿瘤、妊娠、免疫抑制剂用药史。

1.2试剂与仪器 人外周血单个核细胞分离液、RPMI1640细胞培养液、AIMV细胞培养液为天津灏洋生物制品有限责任公司产品，TSPOT.TB为英国Oxford Immunotech 公司产品，CO2培养箱为三洋公司产品，离心机为安徽中科中佳科学仪器有限公司产品。

1.3方法 TSPOT.TB： 在抗结核治疗前用肝素锂抗凝管采集外周静脉血5 mL，淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞(PBMC)，洗涤2次后用AIMV细胞培养液调整细胞浓度为 2.5×105/mL。每份待测样本取出4个细胞培养孔，分别加入ESAT-6(抗原A)、 CFP-10(抗原B)、RPMI1640(阴性对照)及 PHA(阳性对照)各50 μL，再加入调制好的细胞悬液100 μL，37 ℃、5%CO2环境孵育16～20 h。取出培养板用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤4次后加入50 μL酶标二抗工作液(原液用PBS稀释200倍，用时配制)4 ℃孵育1 h。洗涤4次后加入50 μL显色液，避光显色7 min后，用蒸馏水终止反应，干燥后计数抗原A孔和抗原B孔的斑点形成细胞数量(SFCs)，根据试剂盒说明书提供的标准判断试验结果。

1.4统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行数据分析处理。非正态分布的计量资料以M(P25～P75)表示；计量资料及构成比比较分别采用Kruskal WallisH检验和χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13组肺结核患者临床资料比较 3组肺结核患者性别、吸烟史、病程及BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组肺结核患者临床资料比较

2.23组肺结核患者TSPOT.TB的SFCs比较 青年组肺结核患者抗原A、抗原B及抗原A+抗原B的SFCs分别为49.5(29.5～105.0)、80.0(32.5～151.3)及 138.0(80.3～223.5)；中年组肺结核患者分别为32.0(18.0～75.0)、37.0(21.0～126.0)及103.0(48.0～206.0)；老年组肺结核患者分别为15.5(9.0～32.0)、18.5(6.0～49.8)及38.5(21.0～79.5)。经统计分析显示，青年组及中年组肺结核患者抗原A、抗原B及抗原A+抗原B的SFCs均明显高于老年组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 3组肺结核患者的SFCs比较

2.33组肺结核患者不同程度阳性结果的构成分布 根据SFCs将低于下四分位数(P75)的结果定义为强阳性，进一步分析年龄与阳性程度之间的关系。青年组、中年组及老年组肺结核患者抗原A刺激孔SFCs为弱阳性的构成比分别为10.5%、12.3%、77.2%，强阳性的构成比分别为67.7%、19.4%、12.9%；抗原B刺激孔SFCs弱阳性的构成比分别为21.8%、9.4%、68.8%，强阳性的构成比分别为65.6%、21.3%、13.1%；抗原A+抗原B刺激孔SFCs弱阳性的构成比分别为3.4%、8.7%、87.9%，强阳性的构成比分别为66.7%、20.0%、13.3%。3组肺结核患者抗原A刺激孔SFCs、抗原B刺激孔SFCs及抗原A+抗原B刺激孔SFCs比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。Gmma系数分别为-0.876、-0.765及-0.945。见表2～4。

表2 3组肺结核患者TSPOT.TB抗原A刺激孔SFCs结果阳性程度分布(n)

表3 3组肺结核患者TSPOT.TB 抗原B刺激孔SFCs结果阳性程度分布(n)

表4 3组肺结核患者TSPOT.TB抗原A+抗原B刺激孔SFCs结果阳性程度分布(n)

3 讨 论

中国作为30个结核病高负担国家之一，每年新增近90万活动性肺结核患者[1]。第五次全国结核病流行病学调查显示，肺结核的发病率随着年龄增加呈逐渐上升趋势，在75～80岁达高峰，菌阳和涂阳肺结核病例也呈现类似变化趋势，因此，加强对老年肺结核患者的诊断和治疗对我国结核病防治工作有积极意义[10]。传统的实验室检测方法具有耗时长、灵敏度低、假阳性高等缺点，再加上老年结核病患者临床症状常不典型，这些因素都给老年结核病的诊断带来一定困难[11-12]。TSPOT.TB是利用酶联免疫斑点技术，将结核杆菌特异抗原A和抗原B在体外与PBMC共孵育，通过检测分泌干扰素-γ的效应T细胞数量判断机体有无结核杆菌感染。多种报道显示，TSPOT.TB的敏感性存在较大差异[5-6,13]。进一步分析表明，年龄、BMI、病程、人类免疫缺陷病毒感染、人类白细胞抗原多态性等因素可能是造成试验敏感性降低甚至呈假阴性的因素[8,14]。本研究在平衡性别、BMI、病程、吸烟史等因素后观察不同年龄肺结核患者TSPOT.TB的SFCs变化趋势，结果表明，肺结核患者随着年龄的增加，抗原A刺激孔、抗原B刺激孔及抗原A+抗原B刺激孔的SFCs均呈下降趋势，老年组SFCs下降最明显。

既往研究显示，随着年龄增长，免疫系统不可避免地会发生衰退，其机制涉及免疫器官、免疫细胞和免疫分子各种水平，如树突细胞对抗原摄取及其成熟能力、外周T细胞数量的稳定及分化、增殖及效应分子分泌能力等[15]。动物模型研究显示，老年鼠在感染结核后，体内结核抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的能力明显降低[16]。因此，老年肺结核患者结核感染T细胞试验中检测斑点数量下降可能与免疫系统的衰退有关，这也提示在将此试验用于肺结核诊断时应考虑年龄因素对试验结果造成的影响。为了避免此种情况可能造成的漏诊，在结核感染T细胞试验中引入其他结核特异性抗原或同时检测多种效应分子(肿瘤坏死因子-α或白细胞介素-12)是一种可行的诊断方法。