胃癌患者血清和组织miR-30a表达与胃泌素及患者临床病理特征的相关性研究*

向进平,周泽伟,孙 娟

重庆医科大学附属第一医院大足医院/重庆市大足区人民医院消化内科,重庆 402360

胃泌素是一种主要由胃窦中的胃泌素表达细胞产生的肽激素，是胃酸输出的重要生理调节因子和胃上皮细胞增殖的调节因子[1]。循环胃泌素-17(G-17)水平升高常见于萎缩性胃炎引起的高胃泌素血症患者，多与幽门螺杆菌(Hp)持续感染及相关慢性炎性反应有关[2]，易增加胃腺癌和神经内分泌肿瘤的发生风险[3]。既往有研究证实，胃泌素在胃癌组织中呈高表达，并且与胃癌晚期、淋巴结转移和预后不良有关[4]。然而，胃泌素影响胃癌发生的潜在分子途径及其调控机制还有待进一步研究。众所周知，微小RNA(miRNAs)控制着大部分基因组的转录或转录后翻译过程，而且具有组织特异性和结构稳定性等特点，是癌症诊断、治疗和预后评估方面最具潜力的生物标志物之一[5]。本研究采用Target Scan预测胃泌素可能是miR-30a的候选靶基因之一，基于这一推断，本研究纳入68例胃癌患者，通过检测循环血清和胃癌组织标本中miR-30a相对表达量，分析与胃泌素、患者临床病理特征的相关性，为寻找胃癌治疗的新靶点提供一定的循证数据支持。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究经重庆医科大学附属第一医院大足医院伦理委员会批准，获得所有研究对象知情同意后，采集血液标本和组织标本用于研究。选取2018年3月至2019年12月重庆医科大学附属第一医院大足医院68例胃癌患者作为研究对象。纳入标准：(1)所有患者均经组织病理学证实为胃腺癌；(2)未接受任何形式的化疗、放疗或靶向治疗等术前治疗；(3)接受根治性或非根治性胃癌切除+淋巴结清扫手术。排除标准：(1)合并其他同期或既往恶性肿瘤者；(2)被诊断为全身炎症性疾病、肝硬化或慢性肝衰竭，或肾功能异常者。共收集连续的有完整临床资料和肿瘤组织的68例胃癌患者，男45例，女23例，年龄33～75岁，平均(57.56±11.57)岁。基于美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟分期系统进行TNM分期[6]。另选取30例健康者(年龄、性别、体质量指数、吸烟史等与胃癌患者相匹配)血样作为对照组，所有血常规和血生化指标均正常。

1.2标本采集和处理 胃癌患者在手术前使用静脉穿刺法采集5 mL血样，对照组人群使用体检时采集的血样。室温下凝血后，1 500 r/min离心15 min，收集上清液，置于-20 ℃冷冻待检。对于胃癌患者，在手术过程中获得新鲜组织标本后，立即置于液氮中保存，随后置于-80 ℃长期保存，直至用于RNA提取。使用前调取病理组织切片，由重庆医科大学附属第一医院大足医院病理科医师采用盲法复阅，确定为原发性胃腺癌组织，且癌旁正常组织无癌细胞浸润。胃癌患者的基线评估包括详细病史和体格检查，以及血清肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)19-9、CA125、G-17水平检测。CEA、CA19-9和CA125的临界值分别为5 ng/mL、39 U/mL、35 U/mL。

1.3血清和胃癌组织RNA提取及实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-30a相对表达量 采用miRCURYTM RNA分离试剂盒(丹麦Exiqon公司)从200 μL血清/50 mg胃癌组织匀浆中分离出包括miRNA在内的总RNA。采用miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR Kit(丹麦Exiqon公司)对200 ng RNA进行反转录(42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min)得到cDNA。使用1 μL cDNA模板配制PCR反应体系，在iQ5光学实时PCR仪(美国Bio-Rad公司)上完成PCR：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s+60 ℃ 1 min+72 ℃ 30 s，40次循环。小分子U6被用作胃癌组织和血清标本数据正常化的内源性控制。用2-ΔΔCt法测定胃癌组织与癌旁正常组织、血清标本中miR-30a相对表达量。miR-30a：正向5′-GCA GCT GCA AAC ATC CGA C-3′和反向5′-GCG ACT GTA AAC ATC CTC GAC T-3′；U6：正向5′-GAG ACG GGA ACG ACA AAC CT-3′和反向5′-TGG ACG AAG AGG ATT CGC TG-3′。

1.4生物信息学分析 采用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,http://gepia.cancer-pku.cn)数据库和OncomiR数据库(http://www.oncomir.org)分析胃泌素基因(GAST)和miR-30a在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达量，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。

1.5双荧光素酶报告基因分析 采用GAST-3′UTR野生型或突变型和miR-30a模拟物的pLMP载体共转染HEK-293细胞。转染48 h后取细胞进行裂解。用双荧光素酶报告者检测系统(美国Promega公司)在转染后48 h进行报告者检测，并用共转染的肾素荧光素酶对转染效率进行标准化。所有试验至少进行3次。

2 结 果

2.1生物信息学数据库分析GAST和miR-30a在胃癌组织中的表达量及与预后的关系 GEPIA数据库分析显示，胃癌组织GAST表达量较癌旁正常组织升高，差异有统计学意义(P<0.05)；OncomiR数据库分析显示，胃癌组织中miR-30a表达量低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析显示，GAST与miR-30a表达量呈明显负相关(r=-0.520，P<0.05)。采用上述数据库进一步分析GAST和miR-30a在胃癌组织中的表达量与生存期的关系，结果发现，高低GAST或miR-30a表达量患者的生存预后差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：A为GEPIA数据库或OncomiR数据库分析GAST和miR-30a在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达差异及相关性，T为胃癌组织，N为癌旁正常组织；B为胃癌组织中GAST和miR-30a不同表达量患者的生存曲线。

2.2双荧光素酶报告基因分析 基于Target Scan预测，miR-30a(358～364 nt)含有与GAST(60～66 nt)靶向结合的互补序列。双荧光素酶报告基因分析结果显示，miR-30a mimics和GAST-3′UTR-WT共转染，荧光素酶相对表达量降低(P<0.05)。见图2。

注：与NC mimics比较，*P<0.05。

2.3胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量 经qRT-PCR检测，与健康者血样比较，胃癌患者血清miR-30a相对表达量明显降低[(0.688±0.279)vs.(1.000±0.200)，t=5.524，P<0.05]；与癌旁正常组织比较，胃癌组织中miR-30a相对表达量明显降低[(0.348±0.244)vs.(1.000±0.175)，t=13.211，P<0.05]。胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量呈正相关(r=0.376，P=0.002)。见图3。

图3 胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量的关系

2.4胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量与临床病理特征的关系 胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量与肿瘤最大径、TNM分期、血清CEA、CA19-9、CA125水平及Hp感染均有关(P<0.05)。见表1。

表1 胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量与临床病理特征的关系

续表1 胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量与临床病理特征的关系

2.5胃癌患者血清miR-30a相对表达量与血清G-17水平的关系 Pearson相关分析显示，胃癌患者血清miR-30a相对表达量与血清G-17水平呈负相关(r=-0.729，P<0.05)。见图4。

图4 胃癌患者血清miR-30a相对表达量与血清G-17水平的相关性

3 讨 论

miRNAs作为一类内源性非蛋白编码的小分子RNA，大约30%的人类基因组具有转录后调控作用，其依赖于互补的RNA-RNA结合抑制翻译、增加切割或诱导靶基因的降解等。由于miRNAs控制着基因组的很大一部分，它们的表达模式具有组织特异性，并且在许多恶性肿瘤中呈表达失调状态，因此，miRNAs有可能成为癌症诊断和治疗的重要靶点。

在既往研究中，LI等[7]构建了差异miRNAs/mRNA表达谱，并鉴定了12种基因因其网络化程度高而被认为是中心基因，包括miR-29c、miR-30a、miR-335、miR-101等，其中miR-30a可能在hub基因调控中发挥重要作用。本研究首先通过生物信息学数据库检索及qRT-PCR对68例胃癌患者血清标本、组织标本进行检测，证实胃癌患者血清中miR-30a相对表达量低于健康对照者，同时，胃癌组织中miR-30a的相对表达量亦低于癌旁正常组织，说明miR-30a在胃癌的发生过程中属于功能性基因。通过分析血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量与胃癌患者临床病理特征的关系，证实肿瘤最大径>5.0 cm、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、血清肿瘤标志物异常升高者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量明显降低，说明miR-30a在胃癌进展中扮演着抑癌基因的角色。miR-30a是许多类型癌症中最有潜力的抑癌基因之一，它可以通过不同的靶基因抑制癌细胞的生长、迁移和侵袭。YU等[8]的研究证实，上调miR-30a表达可以靶向抑制成纤维细胞活化蛋白a活化，进而抑制胃癌转移。LIU等[9]研究证实，miR-30a-5p通过直接靶向胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)抑制胃癌细胞AGS、HGC27、BGC823、SGC7901等的生长和转移。因此，miR-30a-5p/IGF-1R轴可能是胃癌治疗的潜在靶点。

本研究发现，胃癌患者有Hp感染者血清和胃癌组织miR-30a相对表达量低于无Hp感染者。LIU等[10]通过体内试验构建miR-30a基因敲除小鼠模型，与Hp感染的野生型小鼠比较，Hp感染的miR-30a基因敲除小鼠表现出慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、非典型增生及其他癌前病变或腺癌表现的发病率明显增加，并通过影响癌基因的表达促进肿瘤发展。上述结果说明，miR-30a对于Hp感染者胃癌细胞的生长有一定的抑制作用。Hp持续感染和相关慢性炎症引起的慢性胃萎缩与胃癌的发生密切相关，而胃腺萎缩可以促进胃泌素大量分泌。MURPHY等[11]通过几十年的随访数据证实，高胃泌素血症患者人群胃癌的发病风险大大增加。因此，众多学者普遍认为胃泌素是一种致癌生长因子，在结直肠[12]、胃[13]、肝脏[14]等器官的癌症进展中起重要作用。陈远等[15]研究证实，血清G-17在胃癌患者中呈高表达，并且与胃癌晚期、淋巴结转移和预后不良有关；GAST基因的异常表达受转录后水平环境因素的影响，如Hp感染。

本研究为了进一步明确miR-30a在胃癌发生中的作用，首先通过Target Scan生物学软件预测miR-30a存在与GAST mRNA靶向结合的互补序列，并且通过荧光素酶报告基因分析证实，以GAST编码序列为靶点的miR-30a可以有效地沉默GAST的表达。因此，本研究推断胃泌素在胃癌患者血清中的过度表达可能与miR-30a表达下调有关。通过分析胃癌患者血清miR-30a相对表达量与G-17水平的关系，证实二者存在明显负相关。根据上述结果推断，针对miR-30a/胃泌素研发新的靶向治疗药物可能适合于Hp感染引起的胃腺癌的治疗。

综上所述，胃癌患者血清和胃癌组织中miR-30a相对表达量普遍降低，而且与肿瘤最大径、TNM分期、血清学肿瘤标志物水平及Hp感染均有关；此外，GAST是miR-30a的潜在靶基因。因此，miR-30a表达下调可能是胃泌素促进胃癌细胞生长和迁移的重要原因，为针对miR-30a/胃泌素研发靶向治疗胃癌的新型药物提供了新的思路。