基于生物信息学检测PRKCD在肝细胞癌中的表达及意义

李莉娟，宋少华，方晓琳，李海舰，曹东林

广东省第二人民医院检验医学部，广东广州 510317

肝细胞癌(HCC)作为最常见的原发性肝癌，因早期诊断不易、治疗方案有限且预后差，故在过去的几十年中，HCC的发病率及其与HCC相关的死亡人数一直有所增加[1]，现已成为全球第二的癌症相关死亡原因，其发病率仍持续上升[2-3]。因此，寻找早期诊断和治疗HCC的靶分子有重要意义。蛋白激酶Cδ(PRKCD)是一种广泛表达的蛋白激酶，参与多种细胞信号途径,是癌症、糖尿病、缺血性心脏病和神经退行性疾病炎性反应的重要调节因子,通过酪氨酸磷酸化、激活机制和多个亚细胞靶点进行调控[4]。本文通过多个数据库对PRKCD的表达水平与HCC的相关性进行分析比较，探讨PRKCD作为HCC新的诊断和治疗靶点的潜在价值。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1GEPIA数据库 GEPIA数据库(http://gepia.pku.cn/)是基于TCGA和GTEx的一个癌症数据挖掘网站，通过它可以检测PRKCD在HCC中的具体表达情况[5]。

1.1.2HCCDB数据库 HCCDB数据库(http://lifeome.net/database/HCCDB)包括15个数据集，涵盖大约4 000例临床样本，用于探索HCC基因表达和共表达情况[6]。

1.1.3UALCAN数据库 UALCAN 数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)的数据主要来源于TCGA数据库中的相关癌症数据，可在线对PRKCD在HCC的表达情况进行亚组分析[7]。

1.1.4LinkedOmics数据库 LinkedOmics数据库(http://www.linkedomics)可分析来自TCGA癌症相关的多维数据集[8]。本研究采用Pearson相关系数先对PRKCD共表达进行统计学分析，分析结果为火山图和热图。再以LinkedOmics功能模块进行基因本体生物过程和KEGG通路富集分析。等级标准为FDR<0.05，模拟1 000次。

1.2Kaplan-Meier生存曲线分析 Kaplan-Meier标图仪能够评估54k基因(mRNA、miRNA、蛋白)对21种癌症类型生存率的影响，包括乳腺癌(n=7 830)、卵巢癌(n=2 190)、肺癌(n=3 452)和胃癌(n=1 440)。数据库来源包括GEO、EGA和TCGA，该工具的主要目的是基于生存标志物的发现和验证的Meta分析。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0统计软件进行数据分析。采用Kaplan-Meier生存曲线比较生存时间差异[9]，按特异性基因中位表达水平区分HCC患者的生存期[总体生存期(OS)、无复发生存期(RFS)、无进展生存期(PFS)及特异性生存期(DSS)]。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PRKCD在HCC中表达水平分析 为了检测HCC和相邻非肿瘤组织之间PRKCD表达的变化，本研究在一些独立的生物信息学数据库中分析了它们的表达谱。利用TIMER数据库发现，在大多数肿瘤组织中，PRKCD的表达水平较正常组织均升高，尤其是HCC患者；Oncomine 4.5数据库中的数据显示，PRKCD在HCC组织中的表达水平明显高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05) (图1A～C)。

注：A为PRKCD在HCC样品中的表达水平，与正常组织比较，*P<0.05；B和C方框图分别为PRKCD mRNA水平在Roessier肝脏和Roessiers肝脏统计中的表达情况，与正常组组织比较，*P<0.05。

2.2HCCDB数据库中PRKCD的表达谱和共表达网络分析 进一步检测细胞中PRKCD的差异表达水平，12个不同的HCC数据集结果显示，在大多数数据集(8/12)中，如HCCDB1、HCCDB3、HCCDB4、 HCCDB6、HCCDB13、HCCDB15、HCCDB17和HCCDB18的基因表达HCC组织中的PRKCD水平明显高于邻近肝组织。共表达式网络结果显示，共表达式在HCC组织、癌旁组织和正常肝组织中的PRKCD调控网络完全不同，提示PRKCD的表达增多后调控了特异的分子网络，其与HCC的发生密切相关(图2A～C)。

注：A为来自GTEx project的HCC组织；B为邻近肝组织；C为正常组织中CELSR2的共表达网络显示。

2.3HCC患者PRKCD的mRNA表达水平及其与临床病理参数的关系 如图3A所示，男性和女性HCC患者的PRKCD mRNA表达水平均高于对照组；不同体质量的HCC患者PRKCD的mRNA表达水平均明显高于对照组(图3B)；同时HCC患者PRKCD的mRNA明显高表达与种族无关(图3C)；年龄≥21岁的HCC患者PRKCD的mRNA表达水平普遍高于对照组(图3D)；在HCC患者中，PRKCD的mRNA表达水平与肿瘤分期呈正相关，PRKCD呈高水平表达可能与较差的临床特征有关(图3E、3F)。

2.4PRKCD表达水平对HCC患者的临床预后分析 从绘制的生存曲线图发现，无论是OS(图4A)、RFS(图4B)、PFS(图4C)、DSS(图4D)，其PRKCD高表达的HCC患者生存率均比对照组低，且差异均有统计学意义(P<0.05)。其他数据库获得同样的分子结果(图4E)。

注：A～D为基于PRKCD表达的HCC患者OS、RFS、PFS和DSS的Kaplan-Meier分析；E为使用UALCAN数据库确定PRKCD表达式与OS之间的关联。

2.5HCC患者中与PRKCD相关的共表达基因的GO和KEGG通路分析 LinkedOmics数据库包含TCGA中371例HCC患者的mRNA测序数据，用于分析PRKCD在HCC中的共表达基因及其相关调控通路。首先找出与PRKCD呈明显正相关和负相关的基因(FDR<0.01)，使用基因集富集分析(GSEA)进行分析GO和KEGG分析。GO分析显示，相关基因主要集中于参与细胞的有丝分裂、端粒控制、细胞周期、染色质组装、细胞器分裂等相关(图5A)。KEGG分析显示，相关基因与DNA复制、同源重组、T细胞受体通路、利什曼病、卵母细胞减数分裂、乙型肝炎、志贺菌病相关(图5B)。结果表明PRKCD主要通过影响肝癌细胞增殖、调控细胞周期等方式促进肿瘤的发生和发展。

注：A为利用GSEA分析HCC中PRKCD共表达基因明显富集的GO相关的生物过程；B为利用GSEA分析HCC中PRKCD共表达基因明显富集KEGG通路分析。

3 讨 论

为探究PRKCD与HCC的调控关系，本研究通过分析一系列数据库发现，HCC患者体内PRKCD表达水平明显升高，且与生存预后不良明显相关。HCC病因广泛，大多数发生于慢性肝病患者，由病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝和酒精相关性脂肪肝引起[10]。许多患者没能在早期被诊断，在肿瘤被发现时已处于中晚期，5年生存率只有6.9%[11]。虽然现在HCC的诊断和治疗等均取得了一定进展，但肝移植仍被认为是HCC最有效的治疗方式之一，而供体不足、费用昂贵且患者终身需服用免疫抑制药物等诸多因素，使其临床应用被限制[12]。

本研究发现，PRKCD表达水平在HCC患者中明显上调，并且与患者的临床特征相关，高水平的PRKCD与HCC患者较低的OS和DFS相关，提示该基因可作为一种促肿瘤因子。据有关数据显示，我国HCC的年病死率在恶性肿瘤死亡中占第2位[13]。PRKCD是第1个通过哺乳动物cDNA文库筛选得到的新的蛋白激酶C亚型，在细胞和组织中广泛表达，可介导膜肌醇磷脂水解产生二酰甘油，并通过将这些化合物结合到其调节域的C1区域而促进肿瘤生长[14]。PRKCD是一种具有多种下游靶蛋白的信号激酶，在多种信号传导途径中发挥作用[15]。PRKCD的活化和细胞内分布可能对细胞凋亡有重要影响，它可以作用于Caspases的上游和下游，PRKCD的全长和催化片段在细胞凋亡刺激下，转移到不同的细胞间隔，包括线粒体和细胞核，这又与肿瘤的耐药性密切相关[16]。因此，后续需要通过详细的体外、体内生物学实验来证实PRKCD对肿瘤细胞活性的影响及其调控机制。

公共在线数据库的靶向基因分析揭示了PRKCD在HCC发展中的重要性，并支持其作为HCC的生物标志物。但研究中1个明显的局限性使转录组测序只能检测静态突变，不能直接提供与蛋白质活性或表达水平相关的信息。PRKCD很有可能是HCC早期诊断和治疗的新靶点，后期可能会通过更加严谨的实验来进一步证实这一结果。