七氟醚吸入对糖尿病模型大鼠空间学习和记忆能力的影响及其机制

伦明辉，杜薇，蔡哲，黄泽清

辽宁省肿瘤医院中国医科大学肿瘤医院麻醉科，沈阳110042

术后认知功能障碍（POCD）是围术期的严重并发症，可导致患者康复延迟、医疗费用增加，甚至病死率增高等，但其发生原因复杂［1］。糖尿病是POCD的第二大诱发因素［2］，糖尿病控制不佳也可致患者轻度认知功能损害（MCI），临床症状以学习和记忆能力下降为主［3］。七氟醚是目前临床上常用的吸入性麻醉药。多年来人们一直认为麻醉药的效应随其药理作用消退而消失，一旦药物消除，靶器官将恢复到以前的状态，但越来越多的证据表明并非如此。最新研究［4］发现，TNF-α 具有调节炎症反应与大脑功能的作用，过多的TNF-α 表达可致认知功能发生衰退。还有研究［5］发现，老年大鼠腹部切开缝合术后海马组织中IL-1β mRNA 水平明显增加，且在迷宫实验中表现出认知功能的灵活性受到影响。七氟醚对糖尿病模型大鼠的空间学习和记忆能力有何影响目前尚无定论。2020年5月-2020年11月，本研究观察了七氟醚吸入对糖尿病模型大鼠空间学习和记忆能力的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器 SPF 级雄性成年SD大鼠72 只，体质量200～260 g，由辽宁省实验动物资源中心（辽宁长生生物技术有限公司）提供，合格证号：NO. 211002300003081。大鼠适应性饲养一周，维持室温22～25 ℃，相对湿度65%～70%，自然昼夜光线，供给充足的饲料和水。七氟醚购自日本丸石制药株式会社（批号2222），链脲佐菌素（STZ）购自Sigma 公司。Accu-chek Active 血糖仪及试纸购自Roche Diagnostics GmbH 公司，Datex Ohmeda 7100型麻醉机及Datex Ohmeda S/5 监护仪购自芬兰Hel⁃sinki 公 司，PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒购自TaKaRa 公司，Brilliant ⅢUltra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix 试剂 盒 购自Agi⁃lent Technologies公司。

1.2 糖尿病模型大鼠的制备、分组及七氟醚吸入方法 48只SD大鼠给予腹腔内注射STZ 53 mg/kg，注射后恢复正常进食饮水，72 h后取静脉血检测血糖，血糖≥16.7 mmol/L 判定为糖尿病模型大鼠造模成功［6］。将糖尿病模型大鼠随机分为2组，即模型组和七氟醚组，每组24只。另24只正常SD大鼠，记为空白对照组。参照CULLEY 等［7］的方法对七氟醚组大鼠进行3.4%七氟醚吸入麻醉干预3 h。模型组及空白对照组大鼠同期吸入30%氧气3 h。

1.3 各组大鼠不同时间点空间学习和记忆能力评估 七氟醚吸入后第1 天和第3 天，每组随机抽取12 只大鼠，采用Morris 水迷宫实验［8］评估大鼠空间学习和记忆能力，包括定位航行实验、反转空间探索实验。①定位航行实验。所有大鼠在实验前6 d 行Morris 水迷宫定位航行训练，实验训练过程中保持平台位置不变。将大鼠由平台所在象限的对侧放入水池，每次实验以120 s 为限，记录动物从入水点到达平台所需时间。训练中若动物在120 s 内找到平台，让其在平台上停留20 s；若动物未能找到平台，计算机停止跟踪，记录时间为120 s，将其放在平台上使其停留20 s。每日上午、下午固定时间各训练一次，重复上述实验，持续6 d。七氟醚吸入后第1天和第3天，记录各组大鼠寻找到平台时间，即为逃避潜伏期。②反转空间探索实验。定位航行实验结束后行反转空间探索实验，即将平台放在对侧的象限，记录大鼠入水后穿越原平台位置次数及找到迁移后平台潜伏期。Morris 水迷宫实验结束后立即断头处死大鼠，分离取出海马组织后立即放入液氮中冷却，存于-80 ℃冰箱内。

1.4 各组大鼠不同时间点海马组织中促炎因子IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 检测 采用荧光定量PCR 法。取各组冷冻保存的海马组织50 mg 放入研钵中，加入液氮迅速研磨，重复3 次；加入1 mL TRIzol 移入离心管中，室温放置5 min；4 ℃条件下12 000×g离心10 min，取上清，加入200µL 氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置5 min，4 ℃条件下12 000×g离心15 min。取无色上层水相400µL，加入500µL 异丙醇，颠倒10 次混匀，室温放置10 min 使RNA 沉淀形成，4 ℃条件下12 000×g离心10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇，吹打洗涤沉淀，4 ℃条件下7 500×g离心5 min，弃上清，空气干燥至乙醇全部挥发；加入无RNA 酶水30µL 溶解RNA，核酸蛋白分析仪测定RNA 浓度。取4 µL RNA 样品稀释25 倍，转移至比色杯中，使用核酸蛋白分析仪检测吸光度，记录OD260和OD260/OD280值，计算RNA 浓度。使用Prime⁃Script®RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒进行反转录，使用Stratagene Mx3000p荧光定量PCR 仪进行PCR 反应。使用Primer-BLAST 设计引物：IL-1β上游引物为5′-CAGCTTTCGACAGTGAGGAGA-3′，下 游 引 物 为5′-TGTCGAGATGCTGCTGTGAG-3′；TNF-α 上游引物为5′-ATGGGCTCCCTCTCATCAGT-3′，下 游 引 物 为5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′；以β-actin 为内参，其上游引物为5′-CGCGAG⁃TACAACCTTCTTGC-3′，下游引物为5′-CGTCATC⁃CATGGCGAACTGG-3′。以2-ΔΔCt表 示 海 马 组 织 中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以±s表示，比较用单因素方差分析及LSD 多重检验法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吸入七氟醚后不同时间点各组大鼠空间学习和记忆能力比较 吸入七氟醚后不同时间点各组大鼠空间学习和记忆能力比较见表1。由表1可知，与空白对照组、模型组和同组内第3天相比，七氟醚组大鼠吸入七氟醚后第1天的空间学习和记忆能力均降低（P均<0.05）。

表1 吸入七氟醚后不同时间点各组大鼠空间学习和记忆能力比较（x±s）

2.2 吸入七氟醚后不同时间点各组大鼠海马组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相对表达量比较 吸入七氟醚后不同时间点各组大鼠海马组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相对表达量比较见表2。由表2可知，与空白对照组相比，模型组和七氟醚组大鼠海马组织中吸入七氟醚后第1 天、第3 天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 均升高（P均<0.05）；与模型组相比，七氟醚组大鼠海马组织中吸入七氟醚后第1天、第3天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 均升高（P均<0.05）；与同组内第3天相比，七氟醚组大鼠海马组织中吸入七氟醚后第1 天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA均升高（P均<0.05）。

表2 吸入七氟醚后不同时间点各组大鼠海马组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA相对表达量比较（x±s）

3 讨论

POCD 是一种病因复杂的围术期严重并发症。目前临床研究［9］已经证实，老龄是非心脏手术术后长期POCD 的惟一独立危险因素。但除了老龄外，合并糖尿病患者可能因体内自身代谢紊乱，在外源性应激下更容易对大脑造成损害［10］。而且糖尿病是目前临床上常见的慢性病之一，其发病率呈逐年上升的趋势，已达到了流行病的程度。临床上糖尿病患者可能由于存在胰岛素抵抗，而使胰岛素的促进神经细胞突触形成、增大胞体面积的作用减弱，进而易致患者认知功能受损，对外来刺激更加敏感。随着对糖尿病的研究深入，越来越多的研究［11］表明，炎症在糖尿病的发生发展过程中起着不可低估的致病作用，而且有研究发现炎症反应和胰岛素抵抗有着紧密的联系。

不同研究者采用腹腔注射STZ 液50～60 mg/kg诱导建立糖尿病模型大鼠。本研究应用腹腔注射STZ 液53 mg/kg，诱导72 h 后取尾静脉血，检测血糖均超过16.7 mmol/L，说明糖尿病模型大鼠造模成功。造模成功后约3 d 大鼠开始出现明显多饮、多食、多尿症状；随着高血糖持续，大鼠随之逐渐出现毛色干枯发黄、精神萎靡等，其一般生理特征与临床糖尿病患者症状和体征相似，符合糖尿病病理生理特征。有研究［12］显示，腹腔注射STZ液55 mg/kg，造模成功后给予充足饲料和水饲养65 d后可形成糖尿病脑病模型，大鼠行为学测试学习和记忆能力显著下降，解剖分离海马组织并镜下观察到海马组织CA1区神经元细胞大量死亡。本实验基于此文献及预实验研究结果选择STZ液诱导糖尿病造模成功后普通饲料饲养大鼠2 周后给予吸入麻醉干预，进而评价大鼠获取空间学习和记忆能力。本实验结果显示，模型组大鼠Morris水迷宫测试逃避潜伏期、反转空间探索实验穿越原平台位置次数及找到迁移后平台潜伏期与空白对照组比较无统计学差异，说明STZ 诱导糖尿病大鼠2 周这单一处理因素并没有影响其空间学习和记忆能力。七氟醚组吸入干预后第1 天大鼠的水迷宫定位航行测试逃避潜伏期与空白对照组比较延长，反转空间探索测试穿越原平台次数减少，表明糖尿病模型大鼠行七氟醚吸入麻醉干预后第1 天其获取空间学习能力受到影响；七氟醚组吸入干预后第1天大鼠的反转空间探索测试寻找到迁移后平台潜伏期与空白对照组比较延长，表明大鼠其获取空间的再学习能力也受到影响。本研究还发现，七氟醚组吸入干预后第3 天大鼠的各项水迷宫测试成绩与空白对照组比较无明显差异，表明吸入麻醉干预后第3天大鼠空间学习记忆能力无明显改变。

POCD 发病机制不明，近年来许多基础研究发现可能与乙酰胆碱含量减少、S100β 蛋白表达增高、tau 蛋白过度磷酸化、β 淀粉样蛋白沉积增加或中枢炎症反应相关。中枢系统促炎因子TNF-α、IL-1β 协同作用下启动炎性级联反应，诱导中性粒细胞不断聚集，最终导致组织器官损伤。BARRIENTOS 等［13］研究也发现，对老龄大鼠脑室内注射IL-1 受体拮抗剂能够有效预防老龄大鼠POCD 和神经炎症的发生。有动物实验研究［14］显示，鞘外注射LPS 激活外周免疫系统能够引起中枢神经系统炎症如IL-1、IL-6 和TNF-α 等促炎因子的增高，后者可能通过直接（外周促炎因子通过激活的转运机制直接渗透过血脑屏障）或间接（促炎因子通过刺激迷走神经）的机制而影响认知功能。本实验结果显示，模型组、七氟醚组大鼠促炎因子IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 的相对表达量较空白对照组均增加。但在七氟醚吸入干预后第3 天其mRNA 表达呈下降趋势，但仍高于空白对照组水平。IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 表达趋势与各组大鼠Morris 水迷宫测试成绩趋势相一致。各组大鼠海马组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相对于空白对照组表达量均有增加且七氟醚组吸入干预后第1 天增加量最多，但Morris 水迷宫测试成绩只有七氟醚组吸入干预后第1 天有统计学差异，据此推测中枢神经系统内IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表达升高只有达到一定程度可能才表现出行为学的改变。

综上所述，七氟醚吸入可致糖尿病模型大鼠出现早期空间学习和记忆能力下降，但这种影响是可逆的，其机制可能与大鼠海马组织中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的表达升高有关。