胃癌间充质干细胞、己糖激酶2对胃癌细胞株HGC-27增殖迁移及葡萄糖代谢能力的调控作用观察

徐静，陈斌，徐榕蔓，朱伟

1 江苏大学附属医院检验科，江苏镇江212001；2 江苏大学医学院；3 南通大学附属海安医院检验科

胃癌一种常见的消化系统肿瘤，具有较高的发病率和病死率［1］。研究［2］发现，肿瘤基质细胞与肿瘤细胞相互作用而促进肿瘤进展。研究［3］显示，肿瘤细胞沃伯格效应与肿瘤发展相关，探究胃癌基质细胞对胃癌细胞葡萄糖代谢的调节作用有利于明确胃癌发展的机制。肿瘤间充质干细胞（TA-MSCs）作为肿瘤微环境基质细胞促进肿瘤的发展［4］。前期研究［5］发现，胃癌间充质干细胞（GCMSCs）分泌的炎性因子高于循环间充质干细胞（MSCs）。GCMSCs通过旁分泌作用促进胃癌的增殖、迁移、肿瘤血管生成和免疫抑制环境的生成［6-7］。己糖激酶2（HK2）作为葡萄糖代谢的关键酶，HK2 水平的升高导致了癌细胞的恶性生物学行为，在调节肿瘤生长和转移中发挥着重要作用［8］。HK2 通过与电压依赖性阴离子通道（VDAC）相互作用结合线粒体外膜促进糖酵解，且通过维持线粒体膜电位阻止细胞色素C 的释放，进而抑制细胞凋亡［9-10］。研究［11］显示，骨髓间充质干细胞（BMMSCs）可通过上调c-Myc 促进胃癌细胞糖酵解。与BMMSCs 相比，GCMSCs 能够产生更多的具有上调肿瘤细胞c-Myc 的细胞因子，包括白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素6（IL-6）、肝细胞生长因子（HGF）等［5］。以上证据表明，GCMSCs具有调节HK2的潜力。GCMSCs 能否调节胃癌细胞株HGC-27 的HK2 表达及通过调节HK2 对胃癌发展的影响尚不明确。2019年3月—2020年6月，本研究观察了GC⁃MSCs、HK2 对胃癌细胞株HGC-27 增殖迁移及葡萄糖代谢能力的调控作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人胃癌细胞株HGC-27 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（北京）。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640 培养基、α-MEM培养基购自以色列Biolhd 公司，脂质体2000（Lipo⁃fectamine®2000）购自美国赛默飞科技公司，HK2 小干扰RNA（siHK2）购自广州市锐博生物科技有限公司，兔抗人HK2 单克隆抗体、兔抗人β 肌动蛋白（βactin）单克隆抗体购自美国CST公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司，细胞计数试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，乳酸检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，6孔、48孔和96孔透明平底培养板购自美国康宁公司。BX41 荧光显微镜购自日本Nikon 公司，800TS 酶标仪、Mini-PROTEAN Tetra 电泳仪购自美国Bio-Rad公司，LAS4000 Mini化学发光曝光系统购自德国GE 公司，生化分析仪XD811 购自迅达公司。

1.2 细胞分组、siHK2 转染及GCMSCs 条件培养基（GCMSC-CM）的用法 HGC-27 细胞用含10% FBS的RPMI 1640 营养液培养，所有细胞均放置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。GC⁃MSCs 生长至80%细胞融合度，弃培养基，经PBS 洗涤3 次，加入含10% FBS 的α-MEM，细胞置于37 ℃5% CO2细胞培养箱内培养48 h，收集细胞上清液，1 000×g离心5 min去除细胞碎片，获得GCMSC-CM。GCMSC-CM 以1∶1 的比例与含10%FBS 的新鲜培养基混合，混合体系用于胃癌细胞的培养。取对数生长期HGC-27 细胞分为4 组，GCMSC-CM 组加入GC⁃MSC-CM 培养，siHK2 组转染HK2 小干扰RNA（si⁃HK2），siHK2 + GCMSC-CM 组转染siHK2 后再加入GCMSCs 条件培养基培养，对照组加入含10% FBS的RPMI 1640 营养液培养。各组细胞继续培养48 h后用于后续实验。

1.3 各组细胞中HK2 蛋白检测 采用Western Blotting 法。取生长状态良好的各组细胞1×106个加入100 µL RIPA 裂解液震荡15 s，冰上温育10 min，重复3次，测定蛋白质浓度后，使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离电泳，蛋白分子量区域充分分离后停止电泳，蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入兔抗人HK2单克隆抗体（稀释度1︰1 000），兔抗人β-actin 单克隆抗体（稀释度1︰1 000）4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤10 min，重复3 次，加入HRP 标记羊抗兔抗体（稀释度1︰3 000），37 ℃孵育1 h，PVDF 膜经TBST 洗涤后使用ECL 试剂盒检测，使用Image J 对条带进行灰度扫描，计算目的蛋白质相对表达量。目的蛋白质相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.4 各组细胞增殖能力观察 采用CCK-8 法。取生长状态良好的各组细胞以5×102个接种于96 孔板，加入10 µL CCK-8 溶液，37 ℃条件下继续培养1.5 h，利用多孔平板阅读器测量各孔450 nm 处的OD 值，以OD 值表示各组细胞增殖能力。实验重复三次，取平均值。

1.5 各组细胞迁移能力观察 采用Transwell 实验。取生长状态良好的各组细胞以6×104个滴加于Transwell 小室上室，将600 µL 含10% FBS 的RPMI 1640 培养基滴加于Transwell 小室下室，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内继续培养12 h，用棉签将未迁移的细胞去除，4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色10 min，PBS 洗涤3 遍，显微镜下随机选取3 个视野，计数迁移细胞数。实验重复三次，取平均值。

1.6 各组细胞葡萄糖代谢能力观察 取生长状态良好的各组细胞以1×106个/mL 的浓度接种于48 孔板，37 ℃、5% CO2湿润环境中培养8 h，收集细胞上清，经800×g离心10 min，使用己糖激酶法和半自动生化分析仪检测各组细胞培养上清中葡萄糖浓度，葡萄糖吸收量为培养基葡萄糖浓度减细胞培养后上清葡萄糖浓度所获差值。采用乳酸检测试剂盒检测细胞培养上清中的乳酸含量。葡萄糖吸收量或乳酸产生越多表示其葡萄糖代谢能力越强。

1.7 统计学方法 使用GraphPad Prism 6 统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中HK2 蛋白相对表达量比较 对照组、GCMSC-CM 组、siHK2 组、siHK2+GCMSC-CM 组细胞中HK2 蛋白相对表达量分别为0.27 ± 0.02、0.56 ± 0.03、0.13 ± 0.01、0.14 ± 0.01，其中siHK2组与siHK2+GCMSC-CM 组细胞中HK2蛋白相对表达量相比，P>0.05，其余组间细胞中HK2 蛋白相对表达量相比，P均<0.05。

2.2 各组细胞增殖能力比较 对照组、GCMSC-CM组、siHK2 组、siHK2 + GCMSC-CM 组OD 值分别为0.56 ± 0.08、0.80 ± 0.09、0.27 ± 0.05、0.32 ±0.01，其中siHK2 组与siHK2+ GCMSC-CM 组OD 值相比，P>0.05，其余组间OD值相比，P均<0.05。

2.3 各组细胞迁移能力比较 对照组、GCMSC-CM组、siHK2 组、siHK2 + GCMSC-CM 组迁移细胞数分别 为（39.00 ± 3.46）、（82.33 ± 2.96）、（14.00 ±2.52）、（18.33 ± 3.76）个，其中siHK2 组与siHK2 +GCMSC-CM 组迁移细胞数相比，P>0.05，其余组间迁移细胞数值相比，P均<0.05。

2.4 各组细胞葡萄糖代谢能力比较 各组细胞葡萄糖代谢能力比较见表1。

表1 各组细胞葡萄糖代谢能力比较（±s）

表1 各组细胞葡萄糖代谢能力比较（±s）

注：与对照组相比，*P<0.05；与GCMSC-CM组相比，＃P<0.05；与siHK2组相比，△P<0.05。

组别对照组GCMSC-CM组siHK2组siHK2+GCMSC-CM组葡萄糖吸收量（mmol/L）4.65±0.24 7.30±0.48*3.13±0.25*＃3.20±0.15*＃△乳酸含量（mmol/L）7.38±0.39 11.34±0.69*5.17±0.30*＃5.27±0.16*＃△

3 讨论

前期研究［11］发现，BMMSCs 通过上调胃癌细c-Myc 促进胃癌细胞的增殖。转录因子c-Myc 能够调节多种细胞代谢酶，包括HK2［12］。HK2 调节细胞糖酵解，同时其在肿瘤进展、心肌损伤修复、肺纤维化及内皮细胞生成中具有重要调节作用。循环MSCs在肿瘤微环境产生的趋化因子作用下定殖于肿瘤部位，在肿瘤细胞或肿瘤微环境中其它基质细胞的作用下转变为GCMSCs。GCMSCs 相对于BMMSCs 具有较强的促胃癌发展的作用。细胞因子芯片分析［13-14］表明，GCMSCs 相对于BMMSCs 能够产生更多的细胞因子，包括IL-8、IL-6、HGF 等，这些细胞因子可通过调节蛋白激酶B（AKT）、信号传导及转录激活蛋白（STAT）等信号调节c-Myc 的表达。因此，我们探究了GCMSCs 旁分泌作用对胃癌细胞株HGC-27 的HK2 表达及通过调节HK2 对胃癌细胞株HGC-27 的发展的影响。GCMSCs 可分泌多种生物活性物质包括细胞因子、趋化因子和外泌体，细胞因子及趋化因子通过作用于细胞表面及细胞内受体激活细胞信号进而调节胃癌细胞糖代谢。外泌体含有多种蛋白及核酸物质具有激活细胞信号、调节转录和蛋白翻译后修饰的作用。调节胃癌细胞糖酵解的关键细胞因子和主要途径还有待于进一步探究。肿瘤细胞代谢重编程有利于肿瘤细胞在缺血、缺氧的肿瘤微环境中存活。HK2 的磷酸化有助于促进肿瘤的发展及促进心脏损伤修复。本研究在体外环境探究了HK2 表达促进胃癌细胞株HGC-27 增殖、迁移和葡萄糖代谢。GCMSCs 是上调胃癌细胞株HGC-27 的HK2 表达的关键因素。GCMSCs 促进胃癌细胞株HGC-27 增殖、迁移及葡萄糖代谢依赖于胃癌细胞株HGC-27的HK2表达。但GCMSC-CM 对胃癌细胞株HGC-27 的HK2 活性及对其磷酸化修饰的作用尚未探究。

研究者曾合成小分子抑制剂靶向抑制肿瘤HK2 用于肿瘤治疗，但因药物的疗效和安全性问题未能实现临床应用［15］。本研究发现GCMSCs 可通过旁分泌作用上调胃癌细胞株HGC-27 的HK2 表达促进胃癌发展。BMMSCs 在向GCMSCs 转化的过程中包含多种细胞信号的激活包括核因子κB（NF-κB）、STAT 信号，这些信号都可成为阻断GCMSCs 旁分泌作用的新靶点。GCMSCs 高表达具备上调胃癌细胞HK2 表达的细胞因子，包括IL-8、IL-6、HGF 等。这些细胞因子及其受体的研究已较明确。目前，满足临床应用的IL-8、IL-6 及HGF 细胞因子中和抗体及受体抑制剂在研发和改进中。小分子阻断剂或治疗抗体可通过抑制信号分子活性或阻断细胞信号受体有效的抑制细胞间信号的传递。因此，明确GC⁃MSCs 调节胃癌细胞糖代谢的关键分子是实现靶向治疗胃癌的关键。

综上所述，加入GCMSC-CM 可提高HGC-27 细胞的增殖迁移及葡萄糖代谢能力，下调HK2 表达可抑制HGC-27 细胞的增殖迁移及葡萄糖代谢能力。阻断GCMSCs旁分泌作用或抑制胃癌细胞HK2表达可能成为胃癌治疗新靶点。