国产药物辅料磺丁基倍他环糊精钠的注射安全性研究

申 健，孙 涛

(1.潍坊学院 化学化工与环境工程学院，山东 潍坊 261061；2.复旦大学 药学院，上海 201203)

0 引言

新冠疫情(COVID-19)仍在全球肆虐。2020年5月1日，美国食品药品管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)授予“吉利德科学”公司的抗病毒药物——瑞德西韦以紧急使用权，用于新冠的临床治疗[1]。SBCD(图1(a))是瑞德西韦的主要成药辅料，在瑞德西韦药物分子制剂化过程中起到了重要的增溶、保护等作用。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的数据，瑞德西韦的12%(重量/体积比)由SBCD构成[2]。

图1 (a)SBCD的化学结构示意图；(b)SBCD与客体药物通过分子识别作用形成包合物的过程

SBCD是美国“Cydex”公司开发出的倍他环糊精的重要衍生物[3]。SBCD是由1,4-丁烷磺内酯与倍他环糊精羟基发生取代反应制备，其上市产品的平均取代度为6.2-6.9。SBCD具备良好的水溶性，溶解度超过50 g；其生物稳定性优于母体倍他环糊精；且其对小分子药物的包合力更强；肾毒性更低，溶血性和生物刺激性均较小。因此，SBCD被广泛应用于提高许多小分子药物的注射成药性能[4]。但SBCD的生产及销售，长期以来被匈牙利Cyclolab公司垄断，是我国一款著名的被“卡脖子”的药用辅料产品。在当今复杂国际形势下，开发、研究和实现国产化的SBCD，显得尤为重要。近年来经过不断努力，国产SBCD的生产制备等有了新突破，特别是国内最大的环糊精类产品生产公司——山东滨州智源生物科技有限公司，在环糊精的基础和应用研究领域有了显著进展。进一步缩小与国外先进辅料产品在各方面的差距，是当前亟待研究的课题。

从新药研发角度看，人类使用的药品及辅料都必须经过严格的毒理实验测试，前期需采用动物实验进行安全性评价，以证明其对人体无急、慢性毒性，且无致癌、致病、致畸、致毒、致突变、致残的作用[4]。SBCD主要通过包合作用增溶和稳定小分子药物，这种超分子主客体式成药形式(一般是1∶1的摩尔比，图1(b))，而SBCD分子量一般大于常见小分子药物，这注定在成药过程中SBCD用量相比于其他类型的药用辅料要大得多。加上SBCD可直接用于注射剂型，因此对其毒理学研究是非常有必要性的。鉴于国产SBCD仍属于“卡脖子”级产品，其安全性和大剂量注射研究，成为制约其推广的瓶颈，本课题的开展显得尤为重要。

1 材料和方法

1.1 药物、试剂与器械

SBCD为山东滨州智源生物科技有限公司生产，批号SB20200413、SB20200505、SB20200517，生产日期为2020年4-5月，有效期至2022年4-5月。0.9%生理盐水，自配；75%酒精，自配；1 mL注射器；40 mL灌注注射器；大鼠固定笼。

1.2 动物

清洁级SPF级SD大鼠25只，雄性13只，雌性12只。饲养温度：20-23 ℃，湿度：50%-60%，试验前大鼠禁食(不禁水)12 h。

1.3 SBCD取代度的测定

利用美国药典中推荐SBCD测定标准的毛细管电泳的方法来检测SBCD取代度[5]。具体如流动相：乙腈：0.1 M硝酸钾水溶液(1:4，体积比)；待检测SBCD溶液浓度：10 mg/mL；检测器：示差折光检测器；检测器温度：35±2 ℃；分离柱：7.8 mm×30 cm分析柱，填充L37填料；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.4 红细胞悬液的制备

SD雄性大鼠眼睑取血3 mL，3000 r/min离心10 min去除血浆和纤维蛋白原等，留沉淀红细胞，再加入10倍量的生理盐水，重复离心步骤，反复洗涤三次，至上清液澄清无色，留得的红细胞沉淀用生理盐水配成2%的混悬液，待用。

1.5 溶血作用测定

用生理盐水分别配置浓度为10、20、50、100、150 mg/mL的磺丁基-β-环糊精溶液，EP管中加入200 μL红细胞悬液和800 μL SBCD溶液，摇匀后，置于37 ℃中缓慢摇晃1 h，将温育好的试管溶液以3000 r/min离心10 min后，取上清液转入96孔板中，用酶标仪读取每个试管溶液的OD值，选择的波长为545 nm，阳性对照为蒸馏水，阴性对照为生理盐水。用下面方程式计算溶血率

n=(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)×100%，

其中ODt为受试管吸光度；ODnc为阴性管吸光度；ODpc为阳性吸光度。

1.6 细胞培养

HEK-293细胞用含10%胎牛血清和100 IU/mL的双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养基，置于37 ℃，饱和湿度5% CO2的细胞培养箱中培养，待细胞汇合度达到70%-80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代或制成单细胞悬液，继续培养。

1.7 SBCD对HEK-293细胞存活率的影响

取对数生长期的HEK-293细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×103个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，将96孔板置于37 ℃，饱和湿度5% CO2的细胞培养箱中培养24 h，待其贴壁完全后，每孔分别更换浓度为150、100、50、20、10 mg/mL的两个批次和原研SBCD培养基溶液，设置空白孔(无细胞培养基)和对照空(有细胞，但培养基内不加SBCD)，培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8 增强型溶液，培养箱内培养1 h，利用酶联免疫检测仪测定各孔在450 nm波长处的光密度OD值。则细胞存活率m为

m= [(As-Ab)/(Ac-Ab)] ×100%，

其中As为实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、环糊精)的吸光度；Ac为对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、无环糊精)的吸光度；Ab为空白孔(不含细胞和环糊精的培养基、 CCK-8)的吸光度。

1.8 高浓度SBCD注射液配置

SBCD注射液现配现用。精确称取SBCD25 g，加入到30 mL、0.9%的生理盐水中，在室温、避光下超声2 h，溶解至完全澄清透明状态，避光储存在4 ℃冰箱中。

1.9 大鼠的大剂量静脉注射实验

大剂量静脉注射预实验：先取清洁级SD大鼠4只，体重190-210 g，雌雄各半。注射前大鼠称重，利用大鼠固定装置固定大鼠，75%酒精消毒尾静脉，尾静脉注射给药(3000 mg/kg体重)，每周给药一次，给药时观察大鼠反应，给药后观察大鼠行为，给药2次。给药2周内观察大鼠生存率。

大剂量静脉注射实验：取清洁级SD大鼠25只，雄性13只，雌性12只，体重190-210 g。注射前大鼠称重，利用大鼠固定装置固定大鼠，75%酒精消毒尾静脉，以1.0 mL/250 g尾静脉注射0.9%生理盐水，注射速度为0.5 mL/min，每周给药1次，给药时观察大鼠反应，给药后观察大鼠行为，给药2次。给药2周内观察大鼠生存率。

1.10 大鼠的大剂量静脉注射后灌流实验

将大鼠以10%水合氯醛(0.3-0.4 mL/100 g)或戊巴比妥钠(5-6 mg/100 g)麻醉。切勿麻醉过量，否则大鼠可能在灌流前死亡。大鼠麻醉后，沿剑突上剪开0.5 cm皮肤，钝性分离，不要随意剪以防出血，出血量过大会直接影响灌流效果。后再剪开皮肤、暴露肌层，而后仍需钝性分离肌层暴露肋骨，用有齿镊将肋骨提起，U字型剪开、翻起后以血管钳固定，此时心脏暴露，用眼科剪将心尖部剪裂，用平头灌注针从心尖裂处稍用力即刺入左心室，顺势上探，遇脱空感则为入主动脉。灌流前用生理盐水冲洗输液器并排掉气泡。打开输液器后，开始灌注37 ℃温生理盐水，见右心耳明显充盈后，将右心耳剪开后使血涌出。灌注前20 s，维持速度60-80滴/min，防止初期灌注过快冲破肺部血管致使口鼻出水，使灌流效果不佳；之后控制在150-180滴/min，在灌流400 mL生理盐水(含150 μL肝素注射液)后，后迅速换上4℃的多聚甲醛(4%)生理盐水溶液，约20-40 s内可见大鼠全身明显抽动，约30-60 s后渐止，多聚甲醛灌注应先快后慢，前3-5 min以同生理盐水的速度灌，而后可控制于60-90滴/min，灌流结束后需将组织取出，置于4 ℃的多聚甲醛(4%)生理盐水溶液中后固定24 h，之后石蜡切片并利用苏木精-伊红染色法 (Hematoxylin-eosin staining，HE) 染色，利用显微镜观察HE染色结果。

2 结果和讨论

2.1 SBCD取代度研究

倍他环糊精是由7个D-吡喃葡萄糖构成的环状低聚糖，每个葡萄糖残基上有3个可被取代的羟基(分别是1、2、6位)，而SBCD是由倍他环糊精作为反应原料，在碱性条件下，羟基被1,4-丁烷磺酸内酯烷基化的钠盐[6]。因此，不同的投料比、加料顺序和反应温度等条件不同，会导致SBCD的取代度有区别。随着SBCD取代度的不同，其包合性能、稳定性，乃至下游溶血性、安全性等参数或性能也均会不同[7]。我们利用毛细管电泳的方法，检测了原研和国产SBCD的取代度的差别。由图2结果可以看出，原研和国产SBCD的取代度差别不大，峰形略有细微差异，峰值取代度均在7左右。因此理论上，原研和国产SBCD对同一小分子药物的包合性能差别不大。

图2 原研和国产SBCD(批号SB20200413)的取代度比较结果

2.2 溶血性

环糊精类衍生物在用于注射给药辅料时，安全性是需考虑的第一因素。尽管FDA已经批准其在食品和药品中的应用，但在内部报告中仍提到：考虑到环糊精类衍生物溶血性，对其参与的注射剂型需额外慎重[8]。红细胞破裂，血红蛋白逸出称为红细胞溶解，简称溶血。溶血指标是辅料用于注射剂型前一个非常重要的参考依据[9]。在辅料生物相容性测试时，如出现严重溶血行为，则该测试辅料不能用于注射剂型。根据《药物非临床研究质量管理规范》，辅料的溶血性测试遵循随机、对照、重复的原则来进行，观察测试辅料对受试动物红细胞的影响。

SBCD浓度小于50 mg/mL时，试管红细胞全部下沉，上清液呈现无色澄明状态，无溶血现象出现。浓度为100、150 mg/mL时，溶液呈淡红色，管底有红细胞残留。国产批号SB20200413、SB20200505、原研组浓度为150 mg/mL时，溶血百分比分别为13.7%，16.3%，14.5%。结果如下。

图3 不同浓度的SBCD浓度的溶血百分比

智源提供的两批SBCD产品在50 mg/mL时，仍展现了令人满意的有限溶血行为。与原研相比，所有数据点均无统计学差异。SB20200505批次，溶血性能甚至优于原研产品。该实验初步为智源SBCD产品，可用于注射剂辅料提供了进一步佐证。

辅料的本身性质、杂质、pH、无机盐(引起渗透压变化)等均可能导致溶血，本实验的进行，验证了智源提供的两批SBCD产品在以上指标中均不亚于原研产品。

2.3 肾毒性

人胚胎肾细胞293(HEK-293)，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系。对HEK-293的细胞毒性进行研究，可用于初步表征药物辅料对人体正常组织、特别是肾组织的生理毒性[10]。三组细胞存活率随SBCD浓度升高逐渐降低，SBCD浓度10 mg/mL时，孵育24 h后细胞存活率大于80%，各组之间的细胞存活率并未存在显著差异(图4)。

图4 不同浓度的SBCD的细胞存活率

智源提供的两批SBCD产品在10 mg/mL时，HEK-293细胞仍有80%以上存活，证明了其较低的细胞毒性。与原研相比，所有数据点均无统计学差异。该实验初步为智源SBCD产品，在用于注射剂辅料时，不会造成生理毒性提供了进一步佐证。

2.4 超大剂量注射安全性

SBCD可作为增强生物相容性、络合剂、增溶剂、渗透剂、稳定剂、片剂或胶囊剂的稀释剂、粘度增加剂和降低水的活性等，用于注射剂、口服固体制剂、眼用制剂、鼻内制剂、吸入剂和外用制剂，还可以作为渗透压剂或增溶剂用于控制制剂等。

因为SBCD分子量较大，所包裹的药物一般都是小分子化合物，一般是1:1应用进行包合[11]。因此，如果后期进行静脉给药的话，环糊精的用量会比真正的发挥疗效的药用量大的多。因此，对SBCD的生物安全性，特别是大剂量注射的安全性考察，显得尤为重要[12]。因此本项研究中，选取了超大剂量的SBCD剂量(3000 mg/kg体重，远远大于常规注射所需浓度)[13]，直接注射进动物体内观察动物的生存和主要脏器变化。如此剂量被证实安全，可顺延推测低于此剂量的SBCD的生物安全性也是良好的。综合前期实验中发现的优秀的耐溶血性，可结合在一起得到SBCD大剂量注射的安全性良好的结论。

表1 大鼠静脉注射大剂量给药预实验结果

表2 大鼠静脉注射大剂量给药正式实验结果

第1周给药：25只大鼠第一次给药完毕后，3000 mg/kg体重。尾静脉打药时大鼠比较暴躁，可能与浓度大时有一定渗透压刺激性有关。生存率100%。给药后大鼠正常进食饮水，无反常现象。

第2周给药：尾静脉打药时大鼠仍然比较暴躁。生存率仍是100%。大鼠体重稳步上升，24 h内监测体温，无显著性变化。但是需要注意的是：6只大鼠(24%)给药尾部部位出现红肿、皮肤轻度溃烂现象。

第3周给药：尾静脉打药时大鼠比较暴躁。生存率仍是100%。大部分大鼠体重稳步上升，24 h内监测体温，无显著性变化。给药后大鼠尾部出现轻微颤抖现象。

20只大鼠(80%)给药尾部部位出现红肿、皮肤轻、中度溃烂现象。因此可以认为，磺丁基-β-环糊精钠生物相容性良好，即时是超大剂量下也不会出现死亡现象。但是超大剂量下SBCD会导致给药溶液胶体渗透压上升，致使给药部位有一定刺激性，在用药时需要注意少量多次、低渗溶液配制药物等操作。经动物伦理委员会动物福利准则评估，给药3次后，如再次给药会导致动物较强疼痛感，不适合继续给药，因此将给药次数停留在3次。以上结果均表明表明SBCD静脉给药安全度较大，为注射用药的包合辅料的临床应用提供了参考依据。

环糊精本身是有淀粉经酶发酵所得，属于典型的低聚糖结构。某些细菌(如大肠杆菌)，有可能利用环糊精或其衍生物作为碳源，进行繁殖，因此热源是环糊精系列产品的重要控制指标。本实验中，给药前后大鼠体温均无明显变化，证明智源生产的SBCD热原控制良好。

给药周期结束后，大鼠麻醉后分别经生理盐水和4%多聚甲醛灌流，包括心肝脾肺肾等主要脏器解剖切片后，经HE染色结果如下。经分析，主要脏器无明显异常现象(图5)。

图5 超大剂量SBCD尾静脉给药(批号SB20200517)三周后主要脏器的HE染色处理结果(放大400倍)，(a)-(e)分别为心、肝、脾、肺、肾(比例尺为25 μm)

3 结论

进一步发展我国“卡脖子”的技术，是当前国内科研界孜孜不倦追求的目标。SBCD作为一种在药物制剂领域需求量巨大，效果良好的材料，其国产化的目标，在当今科研和国际形势下显得尤为迫切，而制剂材料的安全性为首要考虑因素[13]。本文对国产的SBCD的取代度、溶血行为、对肾上皮细胞毒性，以及超大剂量静脉注射安全性等关键数据和指标进行了评估。我们研究发现，山东滨州智源生物科技公司，作为国内环糊精生产和应用领域的领军者，其生产的SBCD的安全性能指标上，基本已达到或超过了Cydex公司原研水平，这为打破国外公司对该关键产品的垄断，奠定了重要基础。