悬钩子属浆果多酚的生理活性及现代提取研究进展

郭俊彤, 程俊侠, 张祺祺,王浩鹏,杨 娜,王凯杰,邵红军

(1.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119;2.陕西省环境监测中心，陕西 西安 710043)

悬钩子属(Rubus L.)是蔷薇科(Rosaceae)的一个大属，全世界约有750余种，广布于除南极洲外的全球各地，尤以北美、欧洲和东亚为多[1]。我国现记录种类多达201种98变种，仅次于北美中心，长江以南地区最丰富，常见种类包括树莓(R.idaeusL.)、黑莓(R.ulmifoliusSchott)、茅莓(R.parvifolius)、山莓(R.corchorifoliusL. f.)、掌叶覆盆子(R.chingiiHu)和插田泡(R.coreanusMaq.)等[2]。目前树莓和黑莓类浆果在欧美栽培利用已久，被视为健康水果而备受追捧，但该属植物在我国大多仍处于野生和半野生状态，栽培时间较短，对消费者来说较陌生。

悬钩子属植物食药用历史悠久。自新石器时代就有采食其野生浆果的记录，到目前为止， 世界上树莓等小浆果的种植规模逐年扩大，其鲜果及副产品的销量持续增加。我国对该属植物的药用早在《神农本草经》中记载[3]：“蓬单，味酸平，主安五藏，益精气。一名覆盆，生平津。”中世纪以后，欧美地区的居民逐渐发现悬钩子属植物的药用价值[4～5]。已有资料和传统药用经验表明，悬钩子属植物对出血、中毒、各类炎症、肾亏阴虚、小儿惊风、神经衰弱等症具有良好的疗效[6～8]。

随着消费者生活水平的改善和健康意识的提高，莓果的市场需求越来越旺盛，带动了莓果全产业链的发展，特别是其在药用和功能食品领域的研究与应用极为活跃[9]。值得注意的是，此类浆果的酚酸和花青素等多酚类物质含量在所有水果中名列前茅，而果蔬多酚的摄入可降低慢性疾病发生的风险[10]。基于此，本文简述了悬钩子属植物营养成分，在系统总结其多酚化学成分和生理功能的基础上，深入分析现代提取分离方法，如双水相提取法、酶提取法和超声波法等在其多酚提取中的应用进展，为该属植物资源的利用开发提供参考。

1 营养成分

悬钩子属植物为果药兼用资源植物，其中树莓被认为是第三代水果的典型[4]。其多汁浆果营养丰富，果味酸甜，色泽宜人，除可鲜食外，更是加工果酱、果冻、果汁和果酒的上乘原料[11～12]。该属植物果实富含维生素、微量元素和膳食纤维等，如悬钩子VE含量远高于苹果，树莓Fe含量是蓝莓的20倍以上，山莓和掌叶覆盆子Se含量特别高，分别为4.17和3.88 mg·100 g-1·FW[9,13]。这极大地激发了浆果类水果的消费，驱动了莓果产业的发展。

2 多酚组成与活性

目前，国内外学者对多种悬钩子属植物不同部位(果实及少量根、茎、叶)中的多酚成分及活性进行了深入研究，涉及黄酮、花色苷、单宁、苯丙素类和简单酚类等不同结构类型。

2.1 酚酸

酚酸作为简单酚类，是自然界的天然酚类抗氧化剂，在悬钩子属植物的果实和根、茎、叶中均有发现[14]，其中对水杨酸的研究居多。不同种的悬钩子属植物，水杨酸含量在发育阶段、部位差异较大。如赵伟伟等[15]报道，蓬蘽悬钩子水杨酸含量在整个发育期呈下降趋势，发育期含量比成熟期高。而王倩倩[16]研究了8种不同月份树莓的水杨酸含量，发现成熟期含量最高，对水杨酸最高含量而言，果实普遍比叶片高。

2.2 黄酮

悬钩子属植物含有丰富的黄酮类化合物，尤其树莓全株都含有黄酮，具有预防冠心病、抗抑郁、抑菌消炎等作用[17]。其种类逐渐被人们发现探究，Petreanu等[18]从空心泡中发现一种罕见的甲氧基化黄酮醇，鉴定为5,7-二羟基-6,8,4'-三甲氧基黄酮醇；Park等[19]从寒莓叶中发现黄酮醇；Wang等[20]从树莓籽和叶中提取并鉴定出没食子酸、绿原酸、槲皮素、山柰酚等黄酮化合物。该属植物的黄酮含量受环境影响较大，但植株本身各部位的分布较均匀。何建明等[21]研究了我国11种不同产地的掌叶覆盆子，发现东部地区的掌叶覆盆子黄酮含量比西部高，且纬度越高，含量越高，由此推测可能与东西部气候差异及日照时间有关，这与张玲等[22]的研究结果一致。

2.3 花色苷

花色苷是花青素与各种糖结合而成的一类水溶性色素，具有抗衰老、保护视力、预防慢性病等作用[10]。值得注意的是，红树莓中25%抗氧化能力由其花青素提供[9]。Borges等[23]通过反相HPLC-PDA-MS3分析发现红树莓中矢车菊素-3-O-槐糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量较高；而王卫东等[24]报道了黑莓的主要花色苷是矢车菊3-O-葡萄糖苷，占全部色素含量的76.92%；Kula等[12]研究发现“Poranna Rosa”黄树莓不含花色苷，其余10种树莓中，黑树莓的花色苷含量是红树莓的411倍，其中主要的花色苷是矢车菊素3-O-芸香糖苷和矢车菊素3-O-木糖基-芸香糖苷。可见不同种类的悬钩子属植物，其花色苷种类和含量差异较大，造成这些差异的原因可能是品种、气候、地理位置等条件的不同。

2.4 单宁

单宁是多酚类化合物的重要组成部分，分为水解单宁(由糅花单宁和没食子单宁组成)、缩合单宁(又名原花青素)和复合单宁，具有抗肿瘤、抗病毒等作用[25]。在悬钩子属植物中，单宁主要存在于果实、叶、根中，尤其是未成熟果实，故而掌叶覆盆子是单宁的丰富来源[4]。研究表明，掌叶覆盆子中含有25种鞣花单宁，包括1个四聚体，2个三聚体，15个二聚体和7个单体，近期发现一种新型单宁chingiitannin A可以有效预防糖尿病[26]。Kula等[12]研究发现树莓果实中的鞣花单宁主要是sanguiin H-6，首次报道了黑莓果实中存在原花青素B1和B2；同样，另有研究表明红树莓果实中也含有原花青素B2[27]。

糅花酸是没食子酸的二聚衍生物，多数以缩合形式(如糅花单宁)存在，少数以游离形式存在，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[25]。不同品种树莓的糅花酸含量差异较大，树莓“Bristol”和“Pokusa”的糅花酸含量为323.5和119.8 mg·100 g-1[28]。在另一项研究中，树莓“野生”和“红宝石”的糅花酸含量则为155.98和39.10 mg·100 g-1[29]。可见，植物品种、生长环境、气候及采摘时期对其含量都有影响。

2.5 苯丙素类

苯丙素类化合物具有抗炎、抑菌、止血等多种生物活性。该类化合物在悬钩子属植物的提取分离报道中凤毛麟角，仅有阿魏酸、咖啡酸、香草酸、肉桂酸及其结合物在少量文献中提及[12,30,31]。

3 现代提取方法

如前所述，悬钩子属植物资源丰富，食药用价值高，在药物、食品和化妆品等领域具有广泛应用。为此，该属植物提取物的制备技术受到广泛关注，发展绿色提取技术尤为重要。

3.1 溶剂浸提法

溶剂浸提法是悬钩子属植物多酚提取中出现最早、最经典的方法。通常以酸性甲醇、乙醇或水等常见溶剂为萃取剂，在特定条件下反复提取多次。该法因工艺简单、成本低廉而被广泛使用，但存在试剂耗量大、耗时长和提取率较低等缺点[32]。研究发现，该属植物不同种的最佳提取料液比不同，少则5 mL·g-1，多则可达60 mL·g-1。但所用试剂量越大，后期植物目标成分浓缩越困难，对环境也会造成一定污染[27,33]。旷慧等[34]选取甲醇、无水乙醇、70%乙醇、丙酮等7种溶剂提取红树莓，结果表明，70%乙醇溶液提取效率最佳，反应时间3.5 h；而Park等[19]将实验材料在80%乙醇中浸泡长达3周，可见该法普遍采用较长的时间来提取目标化合物的活性成分。因此，借助机械摇床、磁力搅拌或与其它提取方法结合可缩短提取时间，提高萃取效率。

3.2 双水相提取法

随着对环境问题的重视，人们不断探索绿色环保的提取方法，双水相提取被认为是传统有机相或水相的绿色替代品，前景十分广阔[35]。双水相体系是将两种亲水性化合物的水溶液以适当浓度比例混合后，自发形成互不相溶的两水相体系，可用于氨基酸、酶、蛋白质、核酸等大分子及多酚、黄酮、花青素等小分子天然产物的分离纯化[36]。该法具有生物降解性、低毒性、易于制备和新颖的特性，也可与超声或微波结合，极大缩短提取时间，提高提取效率[35]。目前该法在悬钩子属植物多酚提取的应用中寥寥无几。励娜等[37]采用超声耦合双水相提取法，通过星点设计与混料设计方法，优化乙醇-硫酸铵双水相体系提取红梅消总皂苷时溶剂各相质量百分比，两种设计方法结果接近，所需最适乙醇和硫酸铵浓度分别为40.01%、12.14%和37%、11%，提取含量分别为2.95 %和3.10%，提取率均高于传统的加热回流法。该法在常温下进行，避免因高热而引起的活性成分损失，极大地提高了目标化合物有效成分的提取率和纯度，为将来的工业化生产提供有力的依据。

3.3 酶提取法

酶提取法是通过酶辅助作用以最大程度保留活性成分的一种新兴提取技术，尤其在果汁、果酒、果油等方面的应用最佳。其工艺条件温和，高效环保，但成本过高[20,38]。悬钩子属浆果含有丰富的果胶和纤维素，通过酶解可使植物细胞壁降解破裂，从而利于有效成分释放。目前采用酶法辅助提取本属植物多酚成分的研究还未普遍，已报道的文献中最为常见的是果胶酶[39]，详见表1。研究发现，将果胶酶与其它的酶(如纤维素酶等)以适当比例结合，在最佳pH、最适温度和最宜时间下酶解，可显著增加提取率[20,39]。由此可见，酶法辅助提取有待进一步优化推广。

表1 酶辅助法提取悬钩子属植物多酚的条件及结果

3.4 超声波法

超声波具有较好的方向性、穿透能力和空化作用，使液体分子间发生剧烈的碰撞和交互作用，导致植物细胞壁迅速破裂，加速释放其中的酚类化合物，从而达到快速提取效果[20,41]。超声波辅助提取具有简便高效、节约溶剂等优点，但部分提取溶剂会污染环境。笔者总结的分离提取技术中，60%的文献选择超声辅助提取本属目标化合物，可见超声波法是目前最具选择的现代提取技术。表2总结了超声辅助法提取该属植物多酚成分的提取条件及结果，可得出：提取溶剂多为酸化甲醇或乙醇，料液比在322 mL·g-1之间，时间大多在30 min左右。与传统的溶剂浸提法相比，该法更加省时节能，提取效率较高，有利于工业化生产。

表2 超声辅助法提取悬钩子属植物多酚的条件及结果

3.5 微波辅助法

近年来，微波辅助萃取以其反应高效性、低能耗和过程易控制等优点，在植物材料中生物活性物质的提取方面已受到广泛关注[49]。微波能够穿透实验材料，使内部的极性分子吸收微波能量，导致内部受热和细胞结构破坏，从而促进细胞内活性成分在较低温度下向溶剂中迅速扩散[50]。目前也有文献报道用于悬钩子属植物多酚成分的提取，张佰清等[51]在提取树莓籽中原花青素成分时发现，所需最佳乙醇浓度为60%、微波功率300 W、料液比1:10 g·mL-1、提取时间3 min，微波辅助法提取率约为传统水提法的3倍，可达7.19 mg·g-1。与其它方法相比，微波辅助在该属植物多酚提取中产率较高、提取时间较短，通常在10 min以内，详见表3。但提取成本偏高，有碍于大规模生产，如何在保证高萃取效率的同时降低生产成本，将是进一步研究的重点。

表3 微波辅助法提取悬钩子属植物多酚的条件及结果

3.6 其他

除了上述提取方法，人们还通过闪式提取、超高压等方式提取悬钩子属植物的有效成分。通过闪式提取对红树莓总多酚进行提取[59]，在48 %乙醇(v/v)、电压150 V、时间57 s的提取条件下，含量最高为(52.24 ± 0.66) mg·g-1。超高压方式提取红树莓籽中黄酮的最优条件为[60]：70 %乙醇(v/v)、超高压压力300 MPa、料液比1∶30、保压时间5 min，含量最高为55.4 mg·g-1。不断改进的现有技术在应用于本属植物活性成分提取的同时，新技术也在不断涌现，朝向环境友好型的目标发展。

4 小结

我国悬钩子属植物资源丰富，栽培规模持续扩大，其浆果营养保健价值高，消费需求潜力巨大，这均利于莓果产业成长发展。该属植物功能成分，特别是多酚类物质的绿色提取技术研究取得了长足进展，而提取物的功能和安全性研究、中试和工厂工艺实践仍比较薄弱，此方面的突破将拓展其在食品、医疗保健、日用化妆品等领域的应用[32]。针对该植物多酚的提取和活性研究等方面已经建立了较为成熟的方法，但多停留在较为普遍的有机溶剂浸提法。虽在超声波、微波、酶提取法等方法上取得一定成果，却多集中在优化提取工艺上，本属植物多酚生理活性及功能的深入研究较少。另外，悬钩子属植物极高的食药价值已得到公认，该属植物多酚在体内的消化代谢、作用机制以及与其它营养素之间的作用关系，仍有待进一步分析研究。