七氟醚麻醉后老年大鼠认知学习障碍与海马KIBRA表达及其介导的AMPA受体膜转运的相关性

王晓坤

（天津医科大学肿瘤医院 麻醉科，天津 300000）

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction,POCD） 指术前无精神障碍的病人，受多种因素的影响麻醉和手术后可出现大脑功能紊乱导致在术后发生的可逆的和波动性的急性精神紊乱综合症[1]。POCD是麻醉术后老年患者常见的神经系统并发症，是影响治疗和预后的的重要因素，更是增加术后并发症的发病率及死亡率[2,3]。有研究表明七氟醚为临床常用吸人麻醉药，可引起术后认知功能障碍。肾脑表达蛋白（kidney and brain expressed protein，KIBRA），广泛表达于人体的脑组织及肾脏组织，KIBRA基因和蛋白与人类记忆有关且发现在健康人记忆相关脑区表达较高[4,5]。KIBRA 与树突和突触极蛋白存在交互作用[4,6]后两者在神经突触可塑性、信号传递中起重要作用[7]。Corneveaux 等[8]对KIBRA与阿兹海默症（AD）的关联研究表明，在AD病人主要脑区KIBRA表达有显著变化。AMPA 受体（α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体，AMPAR）介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递，其在突触后膜的动态表达与长时程增强（long-term potentiation，LTP）、长时程抑制的诱发和维持有关，参与调节学习记忆活动。AMPAR 突触后膜缺失，可致突触损伤和功能障碍，与阿尔茨海默病早期认知障碍密切相关。有研究表明KIBRA通过与其有交互作用的结合伴侣binding partners 参与调节AMPA受体膜的运输[9,10]。基于KIBRA与AD关联研究以及KIBRA在突触可塑性等方面起到的重要作用，本实验探讨KIBRA是否在七氟醚吸入麻醉相关的POCD中是否也起到到重要作用，同时探究这一作用机制是否是通过KIBRA调节AMPA受体的跨膜运输来完成，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料

购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供健康雄性Wistar大鼠72只（清洁级实验动物），16～20月龄，体重500～600g。采用随机数字表法分为2组，每组36只大鼠，⑴对照组；⑵七氟醚麻醉4h组（实验组）。

1.2 麻醉方法

将实验组小鼠置于透明的不完全封闭的麻醉箱中进行麻醉，用麻醉机向麻醉箱中通入七氟醚。利用麻醉气体监测仪监测麻醉箱中的七氟醚含量，氧流量为1L/min。维持七氟醚于1.0最低肺泡有效浓度（minimum alveolar concentration，MAC） 4h。小鼠七氟醚1.0MAC根据参考文献，采用2.5%浓度。麻醉箱底部装有钠石灰以吸收CO2。对照组：将大鼠置于麻醉箱内吸入30%氧气4h，氧流量1L/min。

1.3 检测指标

2组分别取6只大鼠于术后1d，3d，7d进行Y迷宫实验，Y迷宫用医用有机板制作，内外壁贴黑色胶纸。共三个臂，随机定义为1臂、2臂、3臂，各臂夹角为120度。将大鼠放在一个臂的末端，记录10min 内动物进入各个臂的顺序。记录自发交替次数和进入各臂次数总和，并计算自发交替百分比。术后6h每组各6只大鼠取海马组织制备标本，进行聚合酶链式反应实验（polymerase chain reaction，PCR），用反转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测术后AMPA 受体GluR2亚基mRNA水平的改变。免疫印迹实验（Western-blot） 检测，术后第1d，3d，7d每组各8只大鼠取海马组织制备标本，分别提取总蛋白和膜蛋白，采用Western-blot的方法检测，检测KIBRA 和AMPA受体亚单位GluR-2的蛋白表达水平。采用免疫共沉淀法检测检测KIBRA与AMPA受体亚单位GluR-2的相互作复合物的表达水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0统计学软件进行分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s） 表示，重复测量资料比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用成组t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Y迷宫实验

与对照组（C组） 相比，1.0MAC组（M组） 术后1～7d 活动能力和自发交替百分有明显下降，具有统计学差异（P＜0.05），见图1、表1。

表1 2组大鼠术后1d 3d 7d Y迷宫测试结果比较

图1 2组大鼠术后1d 3d 7d Y迷宫测试结果比较

2.2 术后海马组织AMPA受体GluR2亚基mRNA水平的改变

与对照组相比，七氟醚组大鼠术后4h海马组织AMPA 受体GluR2亚基mRNA差异无统计学意义（P＞0.05） 见图2、表2。

图2 2组大鼠术后4h海马组织AMPA受体GluR2亚基mRNA水平的改变

表2 2组大鼠术后4h海马组织AMPA受体GluR2 亚基mRNA水平的改变

2.3 KIBRA活性变化，海马组织KIBRA蛋白水平表达结果

与C组相比，1.0MAC组术后海马组织KIBRA水平降低（P＜0.05），见图3。

图3 2组大鼠术后1d 3d 7d海马组织中KIBRA活性变化

2.4 KIBRA-AMPA受体GluR2亚基共表达情况

采用免疫共沉淀法检测KIBRA与AMPA受体亚单位GluR-2的相互作用，C组相比，1.0MAC组术后1d，3d，7d海马组织KIBRA-AMPA受体GluR2亚基复合物含量降低（P＜0.05），见图4。

图4 2组大鼠1d 3d 7d海马组织与GluR2亚基共表达的KIBRA的水平的比较

2.5 AMPA受体GluR2亚基膜运输的变化

2组大鼠海马AMPA受体GluR2亚基总蛋白差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。与对照组相比1.0MAC七氟烷处理组术后不同时间点海马组织AMPA 受体GluR2亚基膜蛋白水平均降低（P＜0.05），见图5、图6。

图5 2组大鼠术后不同时点海马组织AMPA 受体GluR2 亚基总蛋白结果比较

图6 2组大鼠术后不同时点海马组织AMPA 受体GluR2亚基膜蛋白结果比较

3 讨论

POCD是麻醉术后老年患者常见的神经系统并发症，临床上一般难以准确预测和诊断，是影响治疗和预后的的重要因素。其中全身麻醉药物也是加重认知功能损伤的重要因素之一[11,12]。Y迷宫自发交替反应测试可以检测动物的自发探索行为，可以用来检测海马相关的短期内的记忆能力。本实验结果表明七氟醚1.0MAC组术后几个时间点测量活动能力和自发交替百分比有明显下降，表明1.0MAC七氟酸吸入麻醉引起老年大鼠术后工作记忆损伤，并且能持续到术后7d，提示七氟醚麻醉可诱发老龄大鼠术后学习和记忆功能损伤。

长时程增强（long-term potentiation，LTP） 是指高频刺激突触前传入纤维所引起的突触传递效能的长时间持续性增强现象。LTP被认为是突触可塑性的经典模式，也是研究学习与记忆功能的可靠模型。受体和通道是产LTP的生物学基础。在海马LTP 的发生机制中谷氨酸受体发挥着重要作用，AMPA 受体是离子型谷氨酸受体。有AMPA受体运输与LTP相关研究表明，突触后膜AMPA受体数目的改变（受体运输）是LTP的一种最主要表达机制[13-15]。肾脑表达蛋白（kidney and brain expressed protein，KIBRA），可以编码突触后骨架蛋白，最近的研究结果表明KIBRA作用于包括细胞极性，膜/囊泡转运等多个生理过程。KIBRA与树突和突触极蛋白存在交互作用[16]后两者在突触可塑性信号传递和细胞骨架构成中起重要作用。

2组大鼠术后海马组织AMPA受体GluR2亚基总蛋白无明显差异。差异在于膜蛋白水平，与C组相比七氟醚组术后3个时间点海马组织AMPA受体GluR2 亚基膜蛋白水平降低（P＜0.05）。综合以上结果，表明1.0MAC七氟醚吸入对大鼠海马组织AMPA 受体转录和翻译无影响，但是可以对AMPA受体膜转运产生影响，进而由此诱发术后认知和学习功能损害。实验结果还提示实验组海马组织内的KIBRA表达降低，海马中KIBRA-AMPA受体GluR2 亚基复合物含量降低，提示KIBRA与七氟醚麻醉相关的术后认知功能障碍发生中起到重要作用，起作用机制可能与KIBRA参与调节AMPA受体膜的运输有关。