白杨素对HBx诱导肝癌细胞增殖、凋亡及miR-103/PTEN通路的影响

陈燕 童天夫 许立新 田志明 吴培

(东南大学附属中大医院 1江北院区检验科，江苏 南京 210044；2江北院区介入科；3感染科)

乙型肝炎病毒(HBV)持续感染是肝癌发生的主要因素〔1,2〕。HBV X蛋白(HBx)的反式激活对肝癌的发生发展有重要意义，但其致癌的分子机制尚不清楚〔3〕。临床化疗是治疗肝癌不可或缺的方法，但有毒副作用，且极易形成耐药性从而阻碍化疗药物持续发挥作用，中医药有天然、毒副作用小等优点，中医药治疗恶性肿瘤研究日益增多〔4,5〕，寻求疗效显著的中药治疗肝癌逐渐成为研究热点。白杨素是黄岑、南枣酸、木蝴蝶等许多中药的活性成分，研究显示白杨素可抑制小细胞肺癌〔6〕发生，但关于白杨素在抑制HBx诱导的肝癌生长研究较少。研究显示，磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)在肝癌发生发展中发挥重要作用，miR-103是PTEN的靶基因，李明等〔7〕研究显示，miR-103在肝癌癌组织中异常表达。本研究主要通过观察白杨素对转染HBx蛋白的肝癌细胞系HepG2增殖、凋亡变化，探讨白杨素对HBx-HepG2增殖、凋亡的影响及可能的作用途径，以期为肝癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂及仪器 白杨素购自上海源叶生物科技有限公司(批号B20063-20 mg，纯度>98%)；人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院细胞库；携带HBx基因重组逆转录病毒由本室构建提供；Trizol、BCA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒试剂、Hoechest33258荧光染色试剂盒、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒均购自武汉默沙克生物科技有限公司；RPMI1640培养基购自武汉纯度生物技术有限公司；CCK-8实验相关试剂购自美国Promega公司；鼠源一抗〔Ki67、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、PTEN、GAPDH〕、二抗〔辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠〕购自美国Cell Signal Technology公司。CO2培养箱购自日本Sanyo公司；Elx800酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1稳定转染HBx基因的HepG2细胞株制备 自液氮罐中取出冻存的HepG2细胞株，快速解冻复苏后，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液于37℃的5%CO2培养箱中，培养24 h后加入含有携带HBx基因重组逆转录病毒，3 h后，加入RPMI1640培养液继续培养48 h。当转染率70%时，加入嘌呤霉素进行压力筛选，获HBx-HepG2稳定转染细胞株。通过CCK-8法检测HepG2细胞与HBx-HepG2增殖能力。

1.2.2不同浓度白杨素处理HBx-HepG2 取1.2.1中对数期HBx-HepG2细胞，将细胞密度调整至1×104个/ml并接种于96孔板中，每孔加入180 μl，加入终浓度分别为0、10、20、40、80 μmol/L的白杨素继续培养，HepG2细胞组加入相同体积的含终浓度为0.1% DMSO的RPMI1640培养，每组设置6个复孔，处理48 h后，CKK-8法检测HBx-HepG2细胞生长情况，细胞增殖抑制率=〔1-A药物处理组/A未HepG2细胞组〕×100%〔8〕，实验重复3次，求平均值。

1.2.3细胞分组 分为HepG2组：含0.1% DMSO培养基培养HepG2细胞；HBx-HepG2组：含0.1% DMSO培养基培养HBx-HepG2细胞；各剂量白杨素组：分别加入终浓度为20、40、80 μmol/L的白杨素培养HBx-HepG2细胞。

1.2.4平板克隆法检测白杨素对HBx-HepG2细胞增殖的影响 收集1.2.3中各组细胞，按照文献〔9〕方法进行平板克隆试验，并用含1%结晶紫溶液染色20 min后，流水冲洗染色液，空气干燥，拍照统计细胞克隆数量。

1.2.5Hoechest33258荧光染色法检测细胞凋亡形态 收集1.2.3中各组细胞，按照Hoechest33258荧光染色说明书操作，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6流式AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组HBx-HepG2细胞凋亡情况 收集1.2.3中各组细胞，按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒说明书进行操作，上流式细胞仪进行检测，通过Modfir LT软件分析试验结果。

1.2.7实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测miR-103、PTEN mRNA表达情况 收集1.2.3中各组细胞，分别按照Trizol试剂盒操作说明书、miRNA反转录试剂盒操作提取细胞总RNA、将2 μg RNA反转录为cDNA，按照荧光定量PCR试剂说明配反应体系并加样。上荧光定量PCR仪检测，程序设定为：95℃预处理5 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，以上三步骤共循环40次。miR-103以U6为内参基因，PTEN以GAPDH为从内参基因引物由北京优博兰基因公司合成，miR-103：正向序列：5'-GCGCATCGTTACCATCATCACG-3',反向序列：5'-TTCTTCCTCTGTCCGACGGTCT-3';U6：正向序列：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',反向序列：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；PTEN：正向序列：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向序列：5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'；GAPDH：正向序列：5'-CACGCACTTCCGCACATTCC-3'，反向序列：5'-TCCAGCAGCTCGAAGAGGCA-3'。反应结束后通过2-ΔΔCt法计算miR-103、PTEN mRNA相对表达量。

1.2.8Western印迹检测Ki67、Caspase-3、PTEN蛋白表达 收集1.2.3中各组细胞，加入蛋白裂解缓冲液裂解细胞，提取细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒测定细胞总蛋白含量。经过转模、封闭后，添加(1∶500)鼠抗人Ki67、Caspase-3、PTEN一抗，放置4℃过夜，清洗后添加二抗稀释液放置37℃中孵育2 h，经ECL显色后，置于凝胶成像仪中观察蛋白表达，并保存图像。均以GAPDH蛋白表达水平作为内参。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1上调HBx表达对肝癌细胞系HepG2细胞增殖影响 培养时间分别为0、24、48、72、96 h，HepG2组的OD值分别为〔(0.19±0.01)、(0.41±0.02)、(0.69±0.02)、(1.03±0.03)、(1.05±0.03)〕，HBx-HepG2组的OD值分别为〔(0.19±0.01)、(0.41±0.01)、(1.11±0.03)、(1.64±0.06)、(1.71±0.04)〕。与HepG2组相比，HBx-HepG2组细胞48、72、96 h OD值显著升高(P<0.05)。

2.2白杨素对HBx-HepG2细胞增殖抑制率的影响 作用48 h后，与0 μmol/L白杨素组〔(4.98±0.01)%〕相比，10 μmol/L白杨素组〔(5.00±0.02)%〕对HBx-HepG2细胞增殖抑制率差异不显著(P>0.05)，20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L白杨素组〔(23.45±1.22)%、(38.75±1.84)%、(50.10±2.02)%〕对HBx-HepG2细胞增殖抑制率显著增加，且两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，因此后续选择20、40、80 μmol/L白杨素处理48 h。

2.3白杨素对HBx-HepG2增殖影响 与HepG2组细胞克隆数目〔(172.54±18.95)个〕相比，HBx-HepG2组〔(209.83±41.96)个〕显著增加(P<0.05)；与HBx-HepG2组相比，20、40、80 μmol/L白杨素组〔(201.32±40.33)、(176.55±35.29)、(131.91±26.38)个〕依次下降(P<0.05)。见图1。

图1 平板克隆法检测白杨素对HBx-HepG2增殖影响

2.4白杨素对HBx-HepG2细胞凋亡的影响 与HepG2组、HBx-HepG2组相比，20、40、80 μmol/L白杨素组细胞形态变化显著，发生核固缩、核裂变等改变，正常形态细胞明显较少，凋亡细胞明显增加，见图2。

图2 白杨素对HBx-HepG2细胞凋亡的影响(Hoechst33258荧光染色，×400)

与HepG2组细胞凋亡率〔(3.8±0.7)%〕相比，HBx-HepG2组〔(1.7±0.3)%〕显著降低(P<0.05)，20、40、80 μmol/L白杨素组细胞凋亡率依次升高〔(14.2±2.8)、(17.6±4.3)、(20.0±4.1)%，P<0.05〕。见图3。

图3 流式AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

2.5白杨素对HBx-HepG2细胞增殖、凋亡相关蛋白表达影响 与HepG2组相比，HBx-HepG2组Ki67蛋白表达显著升高(P<0.05)，Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)，20、40、80 μmol/L白杨素组Ki67蛋白表达依次下降(P<0.05)，Caspase-3蛋白表达依次升高(P<0.05)。见图4、表1。

1～5：HepG2组，HBx-HepG2组，20 μmol/L白杨素组，40 μmol/L白杨素组，80 μmol/L白杨素组，下图同图4 白杨素对HBx-HepG2细胞Ki67、Caspase-3蛋白表达的影响

表1 白杨素对HBx-HepG2细胞Ki67、Caspase-3蛋白表达的影响

2.6白杨素对miR-103、PTEN mRNA与蛋白表达的影响 与HepG2组相比，HBx-HepG2组miR-103表达显著升高(P<0.05)，PTEN mRNA、PTEN蛋白表达显著降低(均P<0.05)，20、40、80 μmol/L白杨素组miR-103表达依次降低(均P<0.05)，PTEN mRNA、PTEN蛋白表达依次升高(均P<0.05)。见表2、图5。

表2 白杨素对mir-103、PTEN mRNA与蛋白表达的影响

1～5：HepG2组，HBx-HepG2组，20 μmol/L白杨素组，40 μmol/L白杨素组，80 μmol/L白杨素组图5 白杨素对miR-103、PTEN mRNA与蛋白表达的影响

3 讨 论

肝癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤，HBV感染是引起原发性肝癌的重要原因之一，HBV病毒可产生HBx蛋白，研究显示HBx蛋白与肝癌的增殖、凋亡过程密切相关〔10〕。HBx是有多种生物活性的蛋白质，携带HBx基因重组逆转录病毒感染肝细胞后，可促进HBV在肝细胞中的复制和传播，进而使得宿主细胞免疫失效〔11〕。林松挺等〔12〕研究表明，转染HBx病毒后，肝癌细胞株Bel-7404细胞增殖能力显著增强，与细胞耐药性产生相关。

化疗是治疗肝癌的主要手段之一，但会产生骨髓抑制、胃肠道反应、器官毒性等毒副作用，且易形成耐药性阻碍化疗药物持续发挥作用。中医药有毒副作用小等天然优势，白杨素是一种化学名为5，7-二羟黄酮的黄酮类物质，是黄岑、南枣酸、木蝴蝶等许多中药的活性成分，在蜂蜜及蜂胶中含量丰富，研究显示白杨素及其衍生物有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤凋亡的潜能〔13〕。本研究结果提示白杨素可抑制HBx-HepG2细胞增殖，且随白杨素浓度增加；白杨素可抑制HBx-HepG2细胞增殖能力。Ki67在细胞周期M期表达最高，与细胞合成代谢密切相关〔14〕，提示白杨素可能通过调节细胞周期抑制HBx-HepG2细胞增殖。细胞凋亡是肝癌发生发展进程中的重要环节，本研究提示白杨素处理可剂量依赖地诱导HBx-HepG2细胞凋亡。Ahuja等〔15〕研究发现Caspase-3抑制剂DEVD-CHO能抑制HepG2肝癌细胞凋亡，表明Caspase-3在细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究提示白杨素可能通过调控Caspase-3蛋白表达诱导HBx-HepG2细胞凋亡。

PTEN是常见的突变抑癌基因，研究显示，人原发性肝癌组织中PTEN在基因、蛋白水平均呈低表达状态，体外实验显示PTEN低表达可促进肝癌细胞增殖，提示PTEN在肝癌发生发展中发挥重要作用〔16～18〕。蔡岳等〔19〕研究表明，皂荚提取物可能通过促进PTEN表达抑制大鼠肝癌细胞增殖过程。Cang等〔20〕通过双荧光素报告证实miR-103是PTEN的靶基因之一。本研究提示白杨素可能通过下调miR-103表达进而促进PTEN表达，抑制HBx-HepG2细胞增殖，促进HBx-HepG2细胞凋亡。