超高效液相色谱－高分辨质谱分析比较油茶籽油与橄榄油的甘油酯组成差异

胡 谦，张九凯，邢冉冉，陈 颖*，康文瀚，3，苗金梁

（1.北京工商大学 食品与健康学院，北京100048；2.中国检验检疫科学研究院，北京100176；3.江南大学食品学院，江苏 无锡214122）

橄榄油是地中海饮食的重要组成，由于其富含不饱和脂肪酸以及大量脂质伴随物（如酚类和生育酚等），而有益于人体健康。油茶是世界上四大木本油料作物之一，油茶籽油是从油茶籽中获取，其物理化学性质和脂肪酸组成与橄榄油非常相似，被誉为“东方橄榄油”［1］。2009年国家发改委、财政部、国家林业局发布《全国油茶产业发展规划（2009－2020年）》，这是我国首次为一个树种出台国家级规划，旨在大力推进油茶籽油产业的发展。油茶籽油作为我国特色的木本植物油具有非常大的发展前景，受到消费者的广泛喜爱与认可。

食用油的主要营养成分为甘油三酯（Triacylglycerol，TAG），含量高达95%～98%［2］，其次为甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）、游离脂肪酸、酚类、甾醇和磷脂等。油茶籽油和橄榄油的营养价值和化学组分研究一直受到研究者的关注，已有许多研究比较了油茶籽油和橄榄油之间的理化性质、脂肪酸和其它微量成分的差异。油茶籽油的油酸含量高于橄榄油，而棕榈酸和硬脂酸低于橄榄油，维生素E、角鲨烯、植物甾醇可与橄榄油相媲美［3－4］。其β-谷甾醇含量比橄榄油高1.58倍，角鲨烯含量比橄榄油低50倍［5］。曹亮等［6］比较了油茶籽油和橄榄油油炸薯条后品质特性的变化，发现在油炸过程中油茶籽油的酸价显著低于橄榄油，而茴香胺值的增加速率显著高于橄榄油。甘油三酯是食用油的主要营养成分，可为人体提供能量和必需脂肪酸。然而，油茶籽油和橄榄油之间甘油酯的组成差异尚无文献报道。与甘油分子结合的脂肪酸链的长度与不饱和度不同，使得甘油三酯分子的种类复杂多样，其在不同食用油中的组成和丰度存在非常大的差异。而且脂肪酸链的长度、不饱和度及酰基位置不同，会对甘油三酯的消化、吸收和代谢产生影响。确定甘油酯分子在食用油中的组成与丰度，对解析食用油的生物功能和营养健康品质起着至关重要的作用。基于质谱技术的脂质组学已广泛应用于分析食用油中甘油三酯，包括基质辅助激光解吸电离质谱［7－8］、液相色谱质谱联用［9－10］和直接输注质谱［11－12］等。近年来，快速发展的超高效液相色谱－高分辨质谱技术（UPLC－HRMS）对复杂基质中脂质具有非常强大的分离和检测能力［13］，广泛应用于食用油的脂质分析［14］、品种鉴别［15－16］、真伪鉴别［17］和油料育种［18］等领域。

本研究旨在采用基于UPLC－HRMS的脂质组学方法分析油茶籽油和橄榄油的甘油酯轮廓信息，采用独立样本t检验、聚类热图分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS－DA），以全面分析比较油茶籽油和橄榄油的甘油酯分子组成，为解析油茶籽油的功能和营养提供基础，对推动我国油茶籽油产业的发展和推广具有重要意义。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

油茶籽油样品由赣州市产品质量监督检验所从各大油茶籽油加工企业收集，橄榄油购于北京各大商超，样品经乌鲁木齐海关技术中心鉴定，并采用实验室已有指纹图谱方法验证其真实性。为确保样品的完整性，收集样品时尽量覆盖了不同产地和加工方式。22个油茶籽油和22个橄榄油样本信息见表1。所有油茶籽油和橄榄油样品避光储藏于室温。

表1 油茶籽油与橄榄油样本信息Table 1 Camellia oil and olive oil sample information

甲醇、乙腈和异丙醇（德国CNW公司），实验用水（美国Fisher Chemical公司），乙酸铵（美国Sigma-Aldrich公司），所有试剂均为LC－MS级。每个食用油样品精确称取（10±0.1）mg，溶于含有5 mmol/L乙酸铵的10 mL甲醇－异丙醇（1∶1，体积比）中，剧烈涡旋振荡使充分溶解，经0.22 μm聚四氟乙烯滤膜过滤，置于－20℃保存。

1.2 UPLC－HRMS分析条件

SCIEX ExionLC AD超高效液相色谱系统、Triple TOF 5600型质谱仪（美国AB SCIEX公司）。色谱柱采用Phenomenex Kinetex C18柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）。流动相：A为含5 mmol/L乙酸铵的甲醇－乙腈－水（1∶1∶3，体积比）溶液，B为含5 mmol/L乙酸铵的异丙醇溶液。梯度洗脱：0.0～1.0 min，20%B；1.0～3.0 min，20%～70%B；3.0～13.0 min，70%～98%B；13.0～15.0 min，98%B；15.0～15.1 min，98%～20%B；15.1～18.0 min，20%B。流速：0.3 mL/min，柱温：40℃，进样量：1 μL。

使用Analyst TF 1.7.1软件进行数据采集，采用TOF MS模式和信息依赖采集（IDA）模式采集正离子的MS和MS/MS谱图，并结合动态背景扣除和实时多重质量亏损。离子源温度：550℃；喷雾电压：5 500 V；气帘气：207 kPa；雾化气：345 kPa；辅助加热气：379 kPa；去簇电压：80 V。在TOF MS模式，滞留时间：250 ms，扫描质量范围：m/z100～1 200。在IDA模式，碰撞能量：35 eV；扩展碰撞能量：15 eV；滞留时间：50 ms；扫描质量范围：m/z50～1 200。每间隔5个实验样品，使用自动校准系统（CDS）注入APCI校正液自动校准m/z准确度，以维持Triple TOF 5600系统的高质量精度。

1.3 数据处理与分析

使用PeakView 2.2软件中的MasterView插件，并参考LIPIDMAPS数据库［19］，进行甘油酯的定性分析。输入甘油酯的分子式、离子加合方式和保留时间，依据一级精确质量数、同位素分布、保留时间和二级质谱图计算甘油酯的分子种类和峰面积。结合中性丢失质量，推测甘油酯的脂肪酰基链组成［20］。质量误差设置为0.02 Da，保留时间窗口为0.4 min。建立每个食用油样品的甘油酯分子和峰面积的数据矩阵，并对每个样品总甘油酯的峰面积进行归一化处理。

使用MEV 4.9软件进行聚类热图分析，比较油茶籽油和橄榄油之间甘油酯相对含量的差异。使用SIMCA 15.0（瑞典Umetrics）软件进行PCA和OPLS－DA建模。R2X和R2Y分别表示X矩阵和Y矩阵方差的分数，Q2表示模型的预测准确度。为确定模型的拟合质量，进行200次置换检验。

2 结果与讨论

2.1 脂质的液相色谱分离

采用UPLC－HRMS技术，分析了22个油茶籽油和22个橄榄油样本的甘油酯轮廓，获得了大量甘油酯的质谱信息。为全面和准确地鉴定油茶籽油和橄榄油中的甘油酯，首先总结了甘油酯的液相色谱保留规律。

反相液相色谱洗脱程序时长为18 min，由油茶籽油和橄榄油的基峰色谱图（BPC，图1）可知，油茶籽油与橄榄油的甘油酯出峰时间和丰度无明显差异，因此需要分析每种甘油酯分子的丰度。反相液相色谱根据等效碳数（ECN）的大小对甘油酯进行洗脱，即等效碳数=脂肪酰基总碳数－2双键数（ECN=CN－2DB），等效碳数越大，保留时间越长［21］。以脂肪酰基总碳数为54但双键数不同的甘油三酯为例，TAG 54∶7、TAG 54∶6、TAG 54∶5、TAG 54∶4、TAG 54∶3、TAG 54∶2和TAG 54∶1的等效碳数依次增加，其保留时间依次增加，分别为10.1、10.4、10.8、11.1、11.4、11.7、12.1 min。不同等效碳数的甘油三酯被较好地分离，其中含3个双键的脂肪酰基总碳数为54的甘油酯丰度最高。根据食用油中甘油酯的保留时间，确定在6.5～7.5 min洗脱的主要为甘油二酯，在10.6～12 min洗脱的主要为甘油三酯。

2.2 脂质的质谱鉴定

食用油中甘油酯的离子加合方式有3种：［M+NH4］+、［M+Na］+和［M+H］+，且［M+NH4］+的质谱响应最强，因此以［M+NH4］+的加合方式提取甘油酯分子。MasterView插件可查看每一脂质的MS和MS/MS质谱图，无质谱图信息的甘油酯在后续分析中被排除。甘油酯定性依据母离子误差≤5 ppm，且同位素分布误差＜20%，然后依据MS/MS质谱图对甘油酯的脂肪酰基链进行鉴定，确定甘油酯的分子种类。［M+NH4］+离子在碰撞池内易中性丢失1分子NH3和1分子脂肪酸（FA），形成［M－FA+H］+的离子碎片。由于空间位阻作用，sn－2位脂肪酸比sn－1和sn－3位脂肪酸更难丢失，即丢失sn－2产生的碎片比丢失sn－1和sn－3产生的碎片的质谱响应低，但无法准确区分sn－1和sn－3脂肪酸，因此在本研究中认为sn－1和sn－3位脂肪酸等同［22］。此外，酰基脂肪链的断裂规律也受到脂肪酸链长度及不饱和度的影响［23］。综上，甘油酯在碰撞池内的断裂规律受到多种因素的影响，且甘油酯分子的脂肪酰基链组成可能不止1种，因此本研究尚无法依据谱图准确确定甘油酯脂肪酰基链的sn位置分布。

图2 为甘油三酯（TAG 52∶1）的提取离子流图、同位素谱图和二级离子质谱图。TAG 52∶1加合NH4生成带1个正电荷的离子m/z878.817 8，产生3个 碎 片 离 子：m/z577.514 1、579.530 5和605.545 5。依据中性丢失质量计算，分别对应中性丢失了1分子的C18∶0、C18∶1和C16∶0。同理，其它TAG和DAG采用相同方法鉴定，并结合LIPIDMAPS数据库辅助鉴定。表2为油茶籽油和橄榄油中检测的甘油酯分子及其脂肪酰基链组成，油茶籽油和橄榄油的甘油酯分子组成较为类似。共检测到55种甘油酯，包括43种甘油三酯和12种甘油二酯。55种甘油酯在油茶籽油中均被检测到，橄榄油中检测到34种甘油三酯和10种甘油二酯。相比于油茶籽油，橄榄油未检测到2种甘油二酯（DAG 36∶6和DAG 38∶3）和9种甘油三酯（TAG 42∶1、TAG 44∶2、TAG 56∶6、TAG 58∶4、TAG 60∶4、TAG 60∶5、TAG 62∶2、TAG 62∶3和TAG 62∶4）。

图2 TAG 52∶1的鉴定Fig.2 Identification of TAG 52∶1

表2 UPLC－HRMS分析油茶籽油与橄榄油的甘油三酯与甘油二酯组成Table 2 Triacylglycerols and diacylglycerols composition of camellia oil and olive oil by UPLC－HRMS analysis

（续表2）

HRMS技术可从分子层面对甘油酯进行分析，已广泛应用于确定食用油的甘油酯组成。Luo等［24］使用超高效合相色谱－HRMS技术，结合母离子精确质量和碎片离子谱图，确定了橄榄油中23种甘油三酯。Tu等［25］使用超临界流体色谱－HRMS技术，在橄榄油中检测到11种甘油三酯和12种甘油二酯，在油茶籽油中检测到11种甘油三酯和3种甘油二酯。Wei等［26］采用UPLC－HRMS技术在橄榄油和油茶籽油中均检测到11种甘油三酯。本研究采用UPLC－HRMS技术结合提取离子流图、同位素谱图和二级离子质谱图，在油茶籽油中检测到43种甘油三酯和12种甘油二酯，橄榄油中检测到34种甘油三酯和10种甘油二酯，获得了更详细的油茶籽油和橄榄油的甘油酯组成信息。并结合中性质量丢失解析了每种甘油酯的二级质谱图，确定了脂肪酰基链组成。

2.3 脂质相对含量的比较分析

通过MasterView插件提取每种甘油酯的峰面积并做归一化处理，比较油茶籽油和橄榄油中甘油酯相对含量的差异。图3为油茶籽油和橄榄油中相对含量大于1%的甘油酯，以平均值和标准偏差表示。油茶籽油中相对含量最高的5种甘油酯依次为TAG 54∶3（34.5±1.8%）、TAG 52∶2（14.5±0.8%）、TAG 54∶4（14.3±0.8%）、TAG 52∶3（7.4±0.5%）和TAG 54∶5（5.4±0.6%）。橄榄油中相对含量最高的5种甘油酯依次为TAG 54∶3（30.3±2.1%）、TAG 52∶2（18.0±1.0%）、TAG 54∶4（11.8±1.1%）、TAG 52∶3（9.2±0.7%）和TAG 54∶2（5.9±0.9%）。独立样本t检验表明，油茶籽油与橄榄油中DAG 36∶3、TAG 50∶1、TAG 50∶2、TAG 52∶1、TAG 52∶2、TAG 52∶3、TAG 54∶2、TAG 54∶3、TAG 54∶4和TAG 54∶5的相对含量存在显著差异（p＜0.01）。此外，在油茶籽油中检测到而未在橄榄油中检测到的2种甘油二酯和9种甘油三酯的相对含量均低于1%。

图3 油茶籽油与橄榄油中相对含量大于1%的甘油酯Fig.3 Glycerolipids with relative content greater than 1%in camellia oil and olive oil

以55种甘油酯的峰面积，对22种油茶籽油和22种橄榄油进行聚类热图分析（图4）。上侧树状为油茶籽油和橄榄油间的聚类，左侧为甘油酯的聚类，中部颜色表示甘油酯相对含量的高低。在聚类热图中，油茶籽油和橄榄油被较好地分为两类，可以准确描述油茶籽油和橄榄油中甘油酯相对含量的差异。

图4 油茶籽油（YCZY）和橄榄油（GLY）的聚类热图分析Fig.4 Clustering heat map analysis of camellia oil（YCZY）and olive oil（GLY）

本研究发现无论是油茶籽油还是橄榄油，相对含量最高的前5种甘油酯分子的脂肪酰基链均含有1～3条油酸（C18∶1）。三油酸甘油酯（TAG 54∶3）是橄榄油中最主要的甘油三酯，这与Tu等［25］研究一致，也是油茶籽油中最主要的甘油酯。研究表明油茶籽油的油酸含量明显高于橄榄油［3］，本实验发现在甘油酯组成上油茶籽油中三油酸甘油酯的相对含量（34.5±1.8%）显著高于橄榄油（30.3±2.1%）（p＜0.01）。Wei等［26］采用UPLC－HRMS技术分析表明，三油酸甘油酯在油茶籽油（47.69%）中的含量高于橄榄油（45.13%），油茶籽油和橄榄油中三油酸甘油酯的相对含量高于本研究的结果。可能是由于本文检测的甘油酯分子种类更多，详细且全面地了解食用油中甘油酯的组成是对甘油酯准确定量的关键。

据文献报道，大豆油最主要的甘油三酯依次为三亚油酸甘油酯（TAG 54∶6）和油酸二亚油酸甘油酯（TAG 54∶5），菜籽油最主要的甘油三酯为三油酸甘油酯（TAG 54∶3）和二油酸亚油酸甘油酯（TAG 54∶4），葵花籽油最主要的甘油三酯为油酸二亚油酸甘油酯（TAG 54∶5）和三亚油酸甘油酯（TAG 54∶6）［26］。食用油中甘油三酯是膳食脂质的重要来源，油茶籽油和橄榄油主要的甘油酯较为类似，而与其它食用油的差异较大。甘油酯的组成差异会对油脂的消化吸收产生不同程度的影响。

2.4 PCA与OPLS－DA模型

油茶籽油与橄榄油的基峰色谱图（图1）差异不明显，甘油酯分子组成非常类似，但不同甘油酯在丰度上存在差异。为从整体上比较油茶籽油与橄榄油的甘油酯轮廓差异，对甘油酯的相对含量进行PCA和OPLS－DA建模分析。PCA是一种无监督的多变量统计分析方法，能对大量、多维的数据进行降维分析，且无需样品的背景信息，可用于分析样本的归类趋势和异常［27］。而OPLS－DA是一种有监督的分析方法，可忽略组内的随机误差，突出组间差异［28］。

无监督的PCA是数据分析的第一步，图5A是油茶籽油和橄榄油PCA的得分图，所有样本均在95%的置信区间内，未观察到异常样本。油茶籽油与橄榄油在第一主成分和第二主成分上聚集成不同的2类，未出现重叠，第一主成分的贡献率为62.7%，第二主成分的贡献率为18.3%，说明油茶籽油和橄榄油间的甘油酯丰度存在明显差异。随后进行有监督的OPLS－DA，以最大程度地提高组间差异，突出关键变量和潜在差异物，油茶籽油与橄榄油在OPLS－DA得分图上聚集成2类（图5B）。OPLS－DA模型的R2X=0.739，R2Y=0.952，Q2=0.933。S－plot图（图5 C）中离原点越远的甘油酯对模型贡献越大，在油茶籽油和橄榄油中差异越大。OPLS－DA模型经200次置换检验（图5D），R2截距为0.013 1，Q2截距为－0.269。R2Y和Q2的值接近1，差值为0.019，且R2截距＜0.3，Q2截距＜0.05，表明该模型拟合较好，未出现过拟合［29］。虽然有2种甘油二酯和9种甘油三酯仅在油茶籽油中检测到，但这些甘油酯对模型的贡献不明显（VIP值＜1.0），即可能在脂质整体组成上的贡献不大，所以认为这些甘油酯不是关键甘油酯。依据VIP值＞1.0且p值＜0.01筛选油茶籽油和橄榄油的关键甘油酯，结果表明，TAG 54∶3、TAG 54∶4和TAG 54∶5是油茶籽油中的关键甘油酯，TAG 50∶1、TAG 50∶2、TAG 52∶1、TAG 52∶2、TAG 52∶3和TAG 54∶2是橄榄油的关键甘油酯。

图5 油茶籽油与橄榄油中甘油酯的主成分分析与正交偏最小二乘法判别分析Fig.5 Principal component analysis（PCA）and orthogonal partial least squares－discriminant analysis（OPLS－DA）of glycerolipids in camellia oil and olive oil

油茶籽油和橄榄油中的主要脂质为甘油三酯。与甘油分子结合的脂肪酸的脂肪酰基链位置、链长、不饱和度不同，会导致甘油三酯的消化、吸收和代谢产生差异［30］。膳食脂质的消化起始于胃的乳化，10%～30%的甘油三酯会被胃脂肪酶水解为脂肪酸和甘油二酯，甘油三酯的主要消化是在小肠被胰脂肪酶水解为sn－2位甘油一酯和游离脂肪酸，进而通过被动扩散被小肠上皮细胞吸收［31］。从甘油酯组成上看，油茶籽油和橄榄油富含三油酸甘油酯，其在胃肠道中水解为1分子2-油酸甘油一酯和2分子油酸。一项甘油三酯体外消化模型研究表明，甘油三酯的sn－1和sn－3位上的单/多不饱和酸会限制最大游离脂肪酸释放量和表观速率常数，即三棕榈酸甘油酯＞三硬脂酸甘油酯＞三油酸甘油酯［32］。不同游离脂肪酸的消化率会存在明显差异，一般认为短链＞长链，饱和＞不饱和［32］。油茶籽油和橄榄油富含油酸，研究表明高油酸花生油和橄榄油（富含单不饱和脂肪酸）补充喂养可通过调节肠道菌群来改善高果糖高脂饮食小鼠的代谢综合征［33］。本研究筛选到油茶籽油的3种关键甘油酯，橄榄油的6种关键甘油酯，可作为进一步揭示油茶籽油功能和营养的靶标。

3 结论

本文采用UPLC－HRMS技术分析了油茶籽油和橄榄油中甘油酯的组成，发现油茶籽油和橄榄油的BPC差异较小，两者的甘油酯分子组成非常相似。建立了油茶籽油和橄榄油的55种甘油酯分子数据库，获得了全面的甘油酯分子组成信息，发现了大量在油茶籽油和橄榄油中未报道的甘油酯分子。进一步以甘油酯分子的峰面积为分析变量进行多维数据统计分析，发现油茶籽油和橄榄油具有显著的分类趋势。筛选出3种甘油酯作为油茶籽油的关键脂质，6种甘油酯作为橄榄油的关键脂质。结果表明，UPLC－HRMS技术可全面分析食用油的甘油酯组成，结合多变量统计分析可用于区分油茶籽油和橄榄油，为解析油茶籽油的营养和功能提供基础。