UHPLC－MS/MS法分析氯化乙酰甲胆碱雾化气溶胶浓度

朱狄峰，赵剑岚，洪雅雯，钱仁云，陈 超，平 丽

（浙江大学 药学院 药物安全评价研究中心，浙江 杭州310058）

吸入用氯化乙酰甲胆碱是一种供雾化的吸入用粉末制剂，属于乙酰甲胆碱类药物，其主要成分为氯化乙酰甲胆碱。氯化乙酰甲胆碱属于M胆碱受体激动剂，对心血管系统作用较强，也可收缩支气管平滑肌［1－3］。临床上常用作支气管激发试验（MIC）检测气道高反应性的诊断试剂［4－5］。欧洲呼吸学会（ERS）在2017年更新了支气管激发试验技术标准［6］，该标准强调诊断试剂剂量而非浓度的重要性。但是，ERS在随后的研究发现，仅考虑剂量会导致试验存在许多问题和不确定性。作为特殊的给药制剂，吸入给药制剂是通过雾化后的气溶胶进入呼吸道深处的肺部发挥局部或全身作用，因此，ERS建议关注诊断试剂实际雾化吸入的药物浓度［7］。

目前，仅国外报道了氯化乙酰甲胆碱的多种检测方法，包括比色法［8］、离子对液相色谱法［9］和毛细管电泳法［10－11］，但检测浓度范围均在50 μg/mL以上，不适用于低浓度的检测，而雾化气溶胶状态下的浓度检测方法尚无相关报道。乙酰甲胆碱类药物的雾化气溶胶浓度检测存在挑战，致使ERS指南推荐用沙丁胺醇水溶液代替该类药物的检测，以沙丁胺醇气溶胶量外推乙酰甲胆碱气溶胶的药物浓度［7］。然而，此种替代方法带来的弊端是显而易见的，实际乙酰甲胆碱气溶胶量仍未可知。超高效液相色谱－三重四极杆质谱法（UHPLC－MS/MS）是痕量物质检测的常用方法［12－13］。本研究通过改良吸入暴露装置，采用UHPLC－MS/MS法对吸入制剂给药过程中雾化气溶胶中的氯化乙酰甲胆碱进行检测，可用于吸入用氯化乙酰甲胆碱气溶胶的质量控制，也为药物安全性评价和药代药效相关性（PK/PD）研究的供试品分析提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱－三重四极杆质谱联用仪（ACQUITY UPLC I－CLASS+/Xevo TQ system，美国Waters公司）；JAC 4020超声波清洗器（韩国KODO技术研究有限公司）；XS205十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；5810R离心机、Research plus移液器（德国Eppendorf公司）；Purelab Option S7超纯水系统（英国ELGA LabWater公司）；PARI BOY N型压缩雾化吸入机（德国百瑞公司）；YAN30012气溶胶定量雾化注射针（上海玉研科学仪器有限公司）。

吸入用氯化乙酰甲胆碱（商品名：Provocholine，日本三和化工株式会社，规格：每支100 mg）；氯化乙酰甲胆碱对照品（东京化学工业有限公司，含量为100.6%，批号：HKLTH）；内标：酒石酸氢胆碱对照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量≥98%，批号：1108803）。氯化钠注射液（杭州民生药业有限公司，批号：C1808102）。乙腈（色谱纯，德国Merck KGaA公司）；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；其余试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液与供试品溶液的制备

精密称定氯化乙酰甲胆碱对照品适量，用乙腈配制成100 μg/mL的储备液；相同方法配制2.5 μg/mL的内标酒石酸氢胆碱标准溶液。精密吸取氯化乙酰甲胆碱储备液和内标标准溶液适量，用乙腈稀释成质量浓度分别为10、20、50、80、100 ng/mL的标准溶液（内标均为25 ng/mL），即得。

取吸入用氯化乙酰甲胆碱1支，加入氯化钠注射液4.0 mL，振摇溶解配制成质量浓度为25 mg/mL的供试品溶液。

1.3 提取溶剂的制备

精密称定酒石酸氢胆碱对照品适量，用乙腈稀释成25 ng/mL的酒石酸氢胆碱溶液作为提取溶剂。

1.4 雾化气溶胶样品溶液的制备

取吸入用氯化乙酰甲胆碱供试品溶液，倒入压缩雾化吸入机药皿中，将出气口连接至自制吸入暴露装置上口（图1），压缩雾化吸入机的雾化速率为0.25 mL/min，雾化时间为3 min。经雾化机雾化后溶液会迅速形成气溶胶。在室温下雾化1 min后，从吸入暴露装置上、中、下3个位置的中间导管口缓慢抽取含药物的气溶胶至50 mL注射器（内含3 mL提取溶剂）中，抽取后迅速用小胶塞封闭注射器，静置5 min，振摇2 min，重复静置振摇1次，移至离心管进行离心（离心力为8 000 g，离心时间为10 min），上清液作为供试品雾化气溶胶样品溶液。

图1 吸入暴露装置示意图Fig.1 The schematic of inhalation exposure device

1.5 仪器条件

色谱条件：色谱柱为ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温为40℃；以0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱，流速为0.3 mL/min；分析时间为5 min；进样量为5 μL。梯度程序为：0.0～2.0 min，30%～50% B；2.0～3.1 min，50%～90% B；3.1～4.0 min，90% B；4.0～4.1 min，90%～30%B；4.1～5.0 min，30%B。

质谱条件：电喷雾离子源；毛细管电压为2.00 kV；碰撞气流速为0.15 mL/min；离子源温度为150℃；脱溶剂和加热块温度为500℃；脱溶剂气体流速为800 L/h。采用多反应监测（MRM）正离子模式进行监测，总分析运行时间为5 min。锥孔电压、碰撞能量、前体和产物离子等参数见表1。

表1 氯化乙酰甲胆碱及酒石酸氢胆碱的质谱参数Table 1 Mass spectrum parameters of methacholine chloride and choline bitartrate

2 结果与讨论

2.1 检测条件的优化

考察了水－乙腈、水－甲醇、0.1%甲酸水－乙腈、0.1%甲酸水－甲醇作为流动相对氯化乙酰甲胆碱和内标酒石酸氢胆碱的影响，结果显示，以0.1%甲酸水－乙腈作为流动相时的分离效果较好，故选用该溶液作为流动相。考察了ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Agilent Extend－C18柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）和Agilent Eclipse XDB－C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）等不同色谱柱的分离效果，发现采用柱长过短、粒径过大的色谱柱时待测药物的保留时间较短，峰面积重复性较差，不利于药物的洗脱分离。而采用ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）的保留时间和分离效果相对合适，因此选择该柱为色谱分离柱。

氯化乙酰甲胆碱和酒石酸氢胆碱均为季铵碱类化合物，可离子化产生阳离子，因此选择ESI正离子模式进行分析。通过分别注入500 ng/mL的氯化乙酰甲胆碱和内标溶液至质谱仪，使用仪器Intellistart自动调谐功能在MRM模式下对两个化合物进行碎片离子分析，发现氯化乙酰甲胆碱和酒石酸氢胆碱具有2个特征子离子，其m/z分别为101.1、60.1和60.0、45.2，比较最终的响应值和稳定性，确定氯化乙酰甲胆碱和酒石酸氢胆碱的定量子离子分别为m/z101.1和m/z60.0，并获得相应的锥孔电压和碰撞能量。在“1.5”条件下，氯化乙酰甲胆碱和内标与其他干扰物质的分离度良好。图2为优化后样本检测的MRM色谱图。

图2 雾化气溶胶样品溶液的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatograms of aerosol sample

2.2 提取方法的选择

分别比较了水、甲醇、50%甲醇水、50%乙腈水、乙腈作为供试品雾化后提取溶剂的效果，结果显示，水、甲醇、50%甲醇水、50%乙腈水作提取溶剂时，氯化乙酰甲胆碱的峰形出现拖尾现象。乙腈作为提取溶剂时氯化乙酰甲胆碱的出峰较好，提取回收率超过95%，因此选择乙腈为提取溶剂（图3）。同时考察了不同注射器体积（10、20、50 mL）的影响，发现注射器体积为10 mL和20 mL时供试品雾化气溶胶样品溶液的浓度低于或接近定量下限，最终采用50 mL注射器。还对比了提取溶液体积（1、2、3、4、5 mL）的影响，结果显示提取溶液体积为1 mL和2 mL时的提取回收率均低于90%，提取溶液体积为4 mL和5 mL时溶液的浓度相对较低，重复性低于3 mL时，因此最终采用3 mL作为提取溶液体积。

图3 乙腈为提取溶剂时氯化乙酰甲胆碱的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatogram of methacholine chloride with acetonitrile as the extraction solvent

2.3 雾化吸入条件的优化

目前，吸入制剂雾化浓度主要采用重量法检测，通过不同滤膜吸附后质量的变化值进行计算［14－18］，该方法适用于粉末类制剂。而溶液类制剂会随着滤膜吸附逐渐达到饱和，导致吸附效率递减，检测的浓度不能反映实际的雾化浓度。本研究自制了简易吸入暴露装置（见图1），可直接抽取雾化气溶胶进行检测。其上部为进气口，下部有调节出气孔，自上而下每隔15 cm有导管连接至外部。

雾化吸入过程中，吸入暴露装置结构、雾化速率和雾化时间是关键因素。考虑到装置主要用于吸入毒性研究，为确保单组动物给药可在一次吸入试验完成，结合每个孔的合理间距，将其设计为高60 cm，直径40 cm的密闭钢质圆筒。同时，对进气口和出气口进行调试后确定孔径大小为3 cm。吸入用氯化乙酰甲胆碱在临床上的使用时间一般低于3 min，25 mg/mL供试品溶液使用的累积吸入剂量一般约为0.3 mg［19］。因此，雾化时间设计为3 min。根据最终的动物预期药物吸入量进行优化后，确定雾化速率为0.25 mL/min，该速率下动物累积预期药物吸入量可达到0.3 mg。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性取空白溶液、标准对照品溶液和供试品雾化气溶胶样品溶液（中间位置样本），吸取5 μL进样分析，其中样品溶液的MRM色谱图见图2。氯化乙酰甲胆碱和内标酒石酸氢胆碱的保留时间分别为1.28、1.11 min，经计算得到两成分的拖尾因子均不大于2.0，与各自相邻峰的分离度均大于3.0。表明两成分的分离度良好，无杂质干扰。

2.4.2 线性关系与定量下限精密量取标准溶液5 μL（质量浓度为10、20、50、80、100 ng/mL，内标均为25 ng/mL）进样分析，得到色谱峰面积。以氯化乙酰甲胆碱的质量浓度（X，ng/mL）为横坐标，氯化乙酰甲胆碱和内标的峰面积比值（Y）为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程。并以信噪比大于10时的最低线性浓度确定为定量下限（LOQ）。结果表明，氯化乙酰甲胆碱在10～100 ng/mL范围内线性良好，标准曲线方程为Y=0.070 0X+0.030 1，r＞0.999，定量下限为10 ng/mL。

2.4.3 仪器精密度取20、50、80 ng/mL的氯化乙酰甲胆碱标准溶液（内标均为25 ng/mL）连续进样6次，计算仪器精密度，其色谱峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为1.2%、1.0%和1.2%，结果表明仪器精密度良好。

2.4.4 加标回收率实验取已知浓度的供试品雾化气溶胶样品溶液（中间位置样本）各3份，加入一定量的标准溶液进样测定，计算加标回收率为98.1%～100%，平均回收率为99.2%，平均RSD为0.80%（见表2）。

表2 加标回收率实验结果（n=3）Table 2 Results of recovery tests（n=3）

2.4.5 提取回收率取氯化乙酰甲胆碱储备液和内标溶液适量，用乙腈稀释得到低、中、高质量浓度的样品（氯化乙酰甲胆碱为20、50、80 ng/mL，内标为25 ng/mL），进样分析得到色谱峰。用气溶胶定量雾化注射针吸取10 μL标准溶液（氯化乙酰甲胆碱为6、15、24 μg/mL），雾化注入至50 mL注射器（内含3 mL提取溶剂）中，其他按雾化气溶胶样品处理，进样分析得到色谱峰。计算两者峰面积的比值得到提取回收率和RSD。结果表明，雾化气溶胶的平均提取回收率为95.7%，RSD为1.8%。

2.4.6 稳定性实验取质量浓度均为20、50、80 ng/mL的标准溶液、供试品溶液，以及该质量浓度下的供试品溶液经雾化1 min后得到的供试品雾化气溶胶样品溶液，分别放置0、4、8、12 h后进样测定，考察氯化乙酰甲胆碱的稳定性。最终计算得到氯化乙酰甲胆碱浓度的RSD均低于1.5%，表明标准溶液、供试品溶液和供试品雾化气溶胶样品溶液均在12 h内稳定。

2.5 供试品雾化气溶胶样品的含量测定

供试品在吸入装置中经雾化1 min后，测得其上、中、下位置的氯化乙酰甲胆碱气溶胶样品平均浓度分别为609.2、604.9、610.2 mg/m3，RSD为1.2%，上、中、下位置的气溶胶浓度基本达到了均一稳定，气溶胶的平均药物浓度为608.1 mg/m3，表明可以用于吸入性评价实验。在用于大鼠吸入研究实验时，根据大鼠肺功能的通气量正常参数值216.02 mL/min（76～517 mL/min）［20－21］，计算得到大鼠在吸入暴露装置经雾化3 min后的累积吸入量约为0.39 mg（0.14～0.94 mg），该吸入量符合预期目的。

3 结论

本文通过比较不同的检测条件和提取方法对雾化气溶胶中氯化乙酰甲胆碱定量的影响，确定以0.1%甲酸水－乙腈为流动相，乙腈为提取溶剂，建立了定量检测雾化气溶胶中氯化乙酰甲胆碱的UHPLC－MS/MS方法。该法快速灵敏，精密度、稳定性和回收率均符合要求。通过设计简易吸入雾化装置，并优化雾化速率、雾化时间，将UHPLC－MS/MS方法成功应用于测定雾化装置中的氯化乙酰甲胆碱气溶胶浓度，发现气溶胶在雾化装置中雾化1 min后即达到均一稳定。该方法适用于吸入性药物评价研究，也为吸入制剂雾化气溶胶供试品分析和有效控制提供了科学依据。